Հոդված
Մեթիլեն կապույտի հակամանրէային հետազոտությունները. բակտերիաներ, սնկեր և լույսով ակտիվացում
Երկու ընթերցող տեսնում են «մեթիլեն կապույտի հակամանրէային ազդեցություն» արտահայտությունը և տարբեր բաներ պատկերացնում։ Մեկը պատկերացնում է կապույտ հեղուկ, որը շփման պահին թունավորում է մանրէներին։ Մյուսը պատկերացնում է միջամտություն, որի ընթացքում ներկանյութն ու կարմիր լույսը միասին ոչնչացնում են դրանք։ Երկու պատկերացումներում էլ որոշ ճշմարտություն կա։ Բայց ոչ մեկը ամբողջական չէ, և դրանք իրար խառնելիս են առցանց պնդումների մեծ մասը սխալ դառնում։
Այս ակնարկի թեման հենց այդ տարբերությունն է։ Բավարար խտության դեպքում մեթիլեն կապույտը մթության մեջ չափավոր թունավորություն ունի։ Կարմիր լույսի տակ այն դառնում է լուսազգայունացնող նյութ. կլանում է ֆոտոն, անցնում ռեակցունակ տրիպլետ վիճակի և առաջացնում օքսիդատիվ քիմիական ռեակցիաներ, որոնք միաժամանակ վնասում են բազմաթիվ թիրախներ։ Լույսով ակտիվացվող այս ռեժիմն ունի իր անունը՝ հակամանրէային ֆոտոդինամիկ թերապիա, և իր պայմանները։ Միայն խտությունը այն չի սահմանում։ Արդյունքը որոշում են ալիքի երկարությունը, լույսի դոզան, ինկուբացիան, թթվածինը և միկրոօրգանիզմը։
Ոչնչացման երկու մոտեցումները
Նախ դիտարկենք մթության մեջ գործող մոտեցումը։ Մեթիլեն կապույտը դրական լիցքավորված ֆենոթիազինիումային ներկանյութ է։ Այն կապվում է մանրէների բջջային պատյանների հետ, տարբեր չափով ներթափանցում բջիջներ և մասնակցում օքսիդավերականգնման ու կապման քիմիական գործընթացներին։ Ֆոտոններ այստեղ չեն մասնակցում։ Ոչնչացում տեղի է ունենում, բայց միայն այնպիսի խտությունների դեպքում, որոնք խիստ տարբերվում են ըստ միկրոօրգանիզմի, իսկ մեխանիզմը չի սահմանափակվում մեկ հստակ թիրախով։
Ֆոտոդինամիկ մոտեցման դեպքում ավելանում է լույսը։ Մոտավորապես 630-ից 680 nm տիրույթի կարմիր ֆոտոնները համընկնում են ներկանյութի կլանման գոտու հետ, իսկ մոնոմերի կլանման գագաթը մոտ 664 nm է։ Կլանումը ներկանյութը տեղափոխում է կարճատև սինգլետ վիճակ, ապա՝ ավելի երկարատև տրիպլետ վիճակ։ Այնուհետև հնարավոր են ռեակցիաների երկու խմբեր։ Type I քիմիական գործընթացներում տրիպլետը էլեկտրոն է փոխանցում սուբստրատին և սկսում ռադիկալային ռեակցիաներ, որոնցում առաջանում են սուպերօքսիդ և հիդրօքսիլային մասնիկներ։ Type II գործընթացներում այն էներգիան անմիջապես փոխանցում է հիմնական վիճակում գտնվող թթվածնին՝ առաջացնելով սինգլետ թթվածին։ Երկուսն էլ կարող են ընթանալ միաժամանակ, և ներկանյութը բացառապես սինգլետ թթվածին առաջացնող նյութ համարելը չափազանց պարզեցված է։ Ֆենոթիազինիումային լուսազգայունացնողների կառուցվածք–ակտիվություն կապի ակնարկը դա անմիջականորեն ցույց է տալիս. հարակից ներկանյութերի բակտերիալ ֆոտոթունավորությունը չէր հետևում միայն սինգլետ թթվածնի ելքին, քանի որ ներթափանցումը, տեղակայումը և մինչև ոչ ակտիվ լեյկո ձև վերականգնումը նույնքան կարևոր էին, որքան ֆոտոֆիզիկան։ Ալիքի երկարության ընտրության հիմքում ընկած ֆոտոքիմիան բացատրված է ներկանյութի և կարմիր լույսի համակցությանը նվիրված ուղեկից ակնարկում։
Սինգլետ թթվածինը կարևոր դեր ունի մի օգտակար հատկության մեջ։ Այն միաժամանակ արձագանքում է բազմաթիվ կենսամոլեկուլների հետ, ուստի հարձակումը բազմագործոն է, ոչ թե ուղղված մեկ ֆերմենտի կամ կապող սպիտակուցի։ Ֆոտոդինամիկ հակամանրէային քիմիաթերապիայի հիմնարար նկարագրությունը սա ներկայացնում էր որպես պատճառ, թե ինչու սովորական կայունության բնութագրերը փոքր նշանակություն ունեն. պենիցիլին կապող լրացուցիչ սպիտակուցը կամ մուտացիայի ենթարկված տոպոիզոմերազը չեն արգելափակում ռեակտիվ թթվածնի հանկարծակի առաջացումը։ Այս տրամաբանությունը հաստատվել է մեթիցիլինի նկատմամբ կայուն Staphylococcus aureus-ի և վանկոմիցինի նկատմամբ կայուն էնտերոկոկերի փորձարկումներում, ինչպես ցույց է տալիս ստորև բերված աղյուսակը։ Սա չի նշանակում, որ կայունությունն անհնար է, այլ միայն՝ որ այն այլ կերպ է գործում։ Արտամղման պոմպերն ու հակաօքսիդանտ պաշտպանական համակարգերը դեռ կարող են փոխել անհրաժեշտ դոզան, հատկապես սնկերի դեպքում։
Միկրոօրգանիզմների և հետազոտական մոդելների աղյուսակ
Այս աղյուսակը հոդվածի հիմնական նյութն է։ Յուրաքանչյուր արժեք վերաբերում է կոնկրետ արձանագրության. նույն ներկանյութը, բայց լույսի այլ դոզան կամ ինկուբացիան տալիս են այլ թիվ։ MBC-ը, MLC-ը և MIC-ը մի՛ համարեք փոխարինելի։ Այստեղ MBC-ը և MLC-ը նշանակում են, որ վերացանքսից հետո կենդանի միկրոօրգանիզմներ չեն հայտնաբերվում, իսկ MIC-ը նշանակում է աճի արգելակում։ Լուսավորման պայմանները նշված են յուրաքանչյուր տողի համար։
| Միկրոօրգանիզմ և մոդել | Արդյունքը մթության մեջ | Արդյունքը լույսի տակ | Պայմաններ |
|---|---|---|---|
| S. aureus NCTC 6571, պլանկտոնային կախույթ | MBC 5 uM | MBC 5 uM | Ակնարկի աղյուսակ, սպիտակ լույս՝ 12 J per cm2 |
| S. aureus NCTC 6571, պլանկտոնային կախույթ | MLC 2.5 uM | MLC 1 uM | 1997 թվականի սկզբնական արձանագրություն, 1.7 mW per cm2՝ 1 ժամ, մոտ 6.3 J per cm2, ինոկուլյումը՝ մոտ 10^6 CFU per mL, ըստ ֆենոթիազինիումային ներկանյութերի ֆոտոբակտերիցիդային ազդեցության սկզբնական հետազոտության |
| MRSA EMRSA-15, պլանկտոնային | MBC 80 uM | MBC 20 uM | Ակնարկի աղյուսակ, մոտ 12 J per cm2, զգայունության քառապատիկ աճ |
| MRSA EMRSA-16, պլանկտոնային | MBC 40 uM | MBC 10 uM | Նույն արձանագրությունը, ինչ վերևում |
| E. coli NCTC 9001, պլանկտոնային | MBC 500 uM | MBC 100 uM | Նույն արձանագրությունը, զգայունության հնգապատիկ աճ |
| P. aeruginosa NCTC 10622, պլանկտոնային | MBC 500 uM | MBC 25 uM | Նույն արձանագրությունը, զգայունության քսանապատիկ աճ |
| E. faecalis NCTC 775, պլանկտոնային | MLC 100 uM | MLC 100 uM | 1997 թվականի արձանագրություն՝ 6.3 J per cm2, այս շտամի և դոզայի դեպքում բարելավում չկա |
| Վանկոմիցինի նկատմամբ կայուն E. faecium, պլանկտոնային | MBC 400 uM | MBC 400 uM | Ակնարկի աղյուսակ, սկզբնական ներկանյութի դեպքում բարելավում չկա, մինչդեռ ավելի հիդրոֆոբ մեթիլացված ածանցյալները բարելավում ապահովել են՝ ըստ վանկոմիցինի նկատմամբ կայուն էնտերոկոկերի հետազոտության |
| Candida albicans, պլանկտոնային | MIC՝ 12.79 ug per mL-ից բարձր | MIC 12.79, 6.39 և 1.59 ug per mL՝ համապատասխանաբար 5, 10 և 15 J per cm2-ի դեպքում | 30 րոպե նախնական ինկուբացիա մթության մեջ, կարմիր LED՝ 600-ից 650 nm, գագաթը՝ 635 nm, ըստ մեթիլեն կապույտի հակասնկային ֆոտոդինամիկ ազդեցության դոզա–պատասխան հետազոտության |
| C. albicans YEM14-ի և արտամղման պոմպերը գերարտահայտող շտամի համեմատություն, CFU-ի ոչնչացում | Կիրառելի չէ | Սկզբնական շտամի մոտ 5 log ոչնչացում, CDR1/CDR2 գերարտահայտող շտամի գրեթե զրոյական ոչնչացում | 100 uM ներկանյութ, 30 րոպե ինկուբացիա, 660 nm՝ 60 J per cm2, ըստ մեթիլեն կապույտով ֆոտոոչնչացման վրա արտամղման պոմպերի ազդեցության հետազոտության |
| Trichophyton rubrum-ի հիֆերի և սպորների համեմատություն | Կիրառելի չէ | Հիֆերի MIC-ը՝ մոտ 6.3 ug per mL, սպորներինը՝ մոտ 2.0 ug per mL; CFU-ի ամբողջական արգելակման համար հիֆերին անհրաժեշտ էր 5 ug per mL և 100 J per cm2, իսկ սպորներին՝ 1.25 ug per mL և 40 J per cm2 | 635 nm ֆոտոդինամիկ արձանագրություն՝ ըստ դերմատոֆիտների զարգացման փուլերի զգայունության հետազոտության |
| 33 տեսակից կազմված հասուն ենթալնդային կենսաթաղանթ, Calgary սարք, օր 6 | Միայն MB՝ ընդհանուր քանակի ավելի քան 80 տոկոս նվազում | MB և 660 nm LED՝ նյութափոխանակային ակտիվության մոտ 55 տոկոս նվազում, համայնքի լայնածավալ վերակազմավորում չկա | 0.01 տոկոս ներկանյութ (100 ug per mL), 660 nm՝ մոտ 330 mW per cm2, 5 րոպե, անաերոբ աճ, ըստ բերանի բազմատեսակ կենսաթաղանթի in vitro հետազոտության |
Երեք օրինաչափություն է առանձնանում։ Նախ՝ գրամդրական ստաֆիլոկոկերը ոչնչանում են ցածր միկրոմոլային մակարդակներում, մինչդեռ գրամբացասական ցուպիկներին մթության մեջ մոտ հարյուր անգամ ավելի շատ ներկանյութ է անհրաժեշտ, քանի որ գրամբացասականների արտաքին թաղանթը սահմանափակում է ներթափանցումը։ Լույսը նվազեցնում է այդ տարբերությունը, բայց չի վերացնում այն։ Երկրորդ՝ մեթիլեն կապույտի հակասնկային ազդեցությունն իրական է, սակայն պայմաններից կախված. լույսի դոզայի աճին զուգահեռ Candida-ի ոչնչացումը կտրուկ ուժեղանում է, իսկ ֆենոտիպի մեկ փոփոխություն, օրինակ՝ արտամղման պոմպի գերարտահայտումը, նույն դոզայի դեպքում կարող է վերացնել 5 log ոչնչացումը։ Երրորդ՝ հասուն կենսաթաղանթն այլ կերպ է արձագանքում, քան կախույթները. հենց այս համատեքստում պետք է դիտարկել բերանի կենսաթաղանթի տողը։
Բակտերիաներ. որտեղ է լույսն առավել օգնում, և որտեղ՝ ոչ
Ստաֆիլոկոկերը զգայուն օրինակն են։ Նույնիսկ համաճարակային MRSA-ի համար ակնարկի աղյուսակում նշված արժեքները լույս կիրառելուց հետո հավասարվում են համեմատության համար օգտագործված վանկոմիցինի ցուցանիշին կամ ավելի ցածր են դառնում։ Դիմեթիլացված ածանցյալներն էլ ավելի լավ արդյունք են տվել, քանի որ մեթիլացումը բարձրացրել է լիպոֆիլությունն ու սինգլետ թթվածնի ելքը՝ միաժամանակ դժվարացնելով լեյկո ձևի վերականգնումը։ Այս քիմիական մանրամասնությունը կարևոր է. այն ցույց է տալիս, որ ոչնչացումը պայմանավորված է նյութի հասցման և ֆոտոֆիզիկայի համակցությամբ, ոչ թե միայն ֆոտոֆիզիկայով։
Գրամբացասական միկրոօրգանիզմները ցույց են տալիս հասցման դերը։ Pseudomonas-ի համար մթության մեջ անհրաժեշտ էր 500 uM, իսկ լույսի տակ՝ 25 uM. սա քսանապատիկ բարելավում է, սակայն լուսավորված պայմանների արժեքը դեռ զգալիորեն բարձր է ստաֆիլոկոկերի միջակայքից։ Կատիոնային լիցքն օգնում է ներկանյութին մոտենալ արտաքին թաղանթին, բայց ներթափանցումը շարունակում է սահմանափակող գործոն մնալ։ Պատրաստուկի կազմը, ինկուբացիայի տևողությունն ու ածանցյալի ընտրությունն ավելի շատ են փոխում այս թվերը, քան նույն ներկանյութի կիրառումը ավելի բարձր դոզայով։
Էնտերոկոկերը զգուշացնող օրինակ են։ Ավելի հին արձանագրություններում E. faecalis-ը լույսից ընդհանրապես առավելություն չէր ստանում, իսկ վանկոմիցինի նկատմամբ կայուն E. faecium-ի համար անհրաժեշտ էր այլ մոլեկուլ, ոչ թե ավելի շատ լույս։ Ով մեթիլեն կապույտի մեկ MBC արժեքը ներկայացնում է որպես ընդհանուր հակաբակտերիալ հաստատուն, սխալ է մեկնաբանում գրականությունը։ Նման հաստատուն չկա։ Կան միայն շտամին, միջավայրին, ինոկուլյումին, ինկուբացիային, ալիքի երկարությանը և լուսային էներգիայի մակերեսային խտությանը հատուկ արժեքներ։ Ինչպես կարդալ այդ արժեքները՝ առանց ինքներդ ձեզ մոլորեցնելու, քննարկվում է ոչնչացման կորերի մեկնաբանման ուղեցույցում։
Սնկեր. զգայուն են, բայց փուլն ու պոմպերն են որոշիչ
Գլյուկաններից, մանաններից և խիտինից կազմված սնկային բջջապատերը ներթափանցման այլ խնդիր են ստեղծում, քան բակտերիաների դեպքում, իսկ սնկերն ունեն նաև ակտիվ պաշտպանական մեխանիզմներ։ Վերևում ներկայացված Candida-ի արտամղման արդյունքը ամենացայտուն օրինակն է. նույն ներկանյութը, նույն լույսը, նույն միջավայրը, բայց գերարտահայտող շտամը գոյատևել է, մինչդեռ սկզբնական շտամը կորցրել է գաղութ առաջացնող միավորների մոտ 99.999 տոկոսը։ Դերմատոֆիտների դեպքում ավելանում է զարգացման փուլի գործոնը։ Սպորները շատ ավելի հեշտ են ոչնչանում, քան հիֆերը, ուստի սպորները վերացնող արձանագրությունը նույն դոզայի դեպքում կարող է հիֆերի բեկորները կենսունակ թողնել։
Այդ պատճառով մեթիլեն կապույտի հակասնկային հետազոտությունների համար լույսի պայմանների նույնքան խիստ վերահսկում է անհրաժեշտ, որքան բակտերիալ հետազոտություններում։ Եղունգների և մաշկի կլինիկական ֆոտոդինամիկ հետազոտություններում 1-ից 2 տոկոս ներկանյութը համակցվել է չափված կարմիր լույսի հետ՝ էներգիայի որոշակի մակերեսային խտություններով և հետագա հսկողությամբ, իսկ կլինիկական տեսքը տարբերակվել է սնկաբանական մաքրումից։ Այդ փորձարկումները քննարկվում են եղունգների և մաշկի սնկային խնդիրների ֆոտոդինամիկ ապացույցների ամփոփման մեջ։ Սենյակային լուսավորության տակ ախտահարված հատվածին նոսր ներկանյութ քսելը վերարտադրում է գույնը, բայց բաց է թողնում միջամտությունը։
Կենսաթաղանթի ստուգումը. բերանի 33 տեսակից կազմված մոդել
Բերանի բազմատեսակ կենսաթաղանթի 2024 թվականի հետազոտությունը ուշադրության է արժանի, քանի որ փորձարկում է բարդ դեպքը, ոչ թե հեշտը։ Բերանի երեսուներեք տեսակ, այդ թվում՝ Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium և բերանի ստրեպտոկոկեր, անաերոբ պայմաններում աճել են՝ 6-րդ օրը ձևավորելով հասուն կենսաթաղանթ։ Մշակումը կատարվել է 0.01 տոկոս ներկանյութով և 660 nm LED-ով՝ 5 րոպե, բարձր ճառագայթման ինտենսիվությամբ։ Ե՛վ միայն ներկանյութը, և՛ միայն լույսը զգալիորեն նվազեցրել են ընդհանուր քանակը, իսկ դրանց համակցությունը նյութափոխանակային ակտիվությունը նվազեցրել է մոտ կեսով։ Այդուհանդերձ, համայնքը չի վերակազմավորվել, և կենսաթաղանթը չի ստերիլացվել։
Սա իրական ազդեցություն է՝ հստակ սահմանով։ Այն հիմնավորում է ֆոտոդինամիկ միջամտության դիտարկումը որպես տեղային օժանդակ միջոց մաքրված գրպանում, ոչ թե որպես ողողման միջոց, որն ինքնուրույն բուժում է ախտորոշված պարոդոնտիտը։ Սա մեզ բերում է ընդհանուր բացին։
Ինչու լաբորատոր ոչնչացումը հավասար չէ բուժմանը
Պլանկտոնային MBC-ի որոշման ժամանակ միատարր բջիջները թթվածնով հագեցած միջավայրում ենթարկվում են միատարր ներկանյութի և հավասարաչափ լույսի ազդեցությանը։ Ախտահարված հյուսվածքում այս պայմաններից ոչ մեկը չկա։ Մատրիքսը դանդաղեցնում է ներթափանցումը, պերսիստերների նման վիճակները դիմանում են օքսիդացմանը, արյունն ու արտաքիրտը կլանում են լույսը, հյուսվածքների երկրաչափությունը ստվերներ է ստեղծում, իսկ թթվածնով աղքատ գրպանները թուլացնում են Type II քիմիական գործընթացները, քանի որ սինգլետ թթվածնի առաջացման համար, ըստ սահմանման, անհրաժեշտ է մոլեկուլային թթվածին։ Խառը վարակների դեպքում ավելանում են ներթափանցման և զգայունության տարբեր հատկություններ ունեցող տեսակներ, ուստի մեկ ստուգիչ շտամի արժեքը չի կարող ներկայացնել ամբողջ օջախը։
Բերանի օրինակը բացը դարձնում է շոշափելի։ Լաբորատոր անոթում Porphyromonas-ի կամ ստրեպտոկոկերի քանակի նվազեցումը կամ աճեցված կենսաթաղանթի ակտիվության կիսով չափ ճնշումը չեն ապացուցում, որ կապույտ ողողման միջոցը բուժում է պարոդոնտիտը, վերացնում է էնդոդոնտիկ վարակը կամ վերացնում է բակտերեմիան։ Պարոդոնտի կլինիկական խնամքը հիմնվում է կենսաթաղանթի մեխանիկական քայքայման ու հեռացման, ինչպես նաև գրպանի անատոմիական առանձնահատկությունների կառավարման վրա, իսկ լույսի վրա հիմնված միջամտությունն ուսումնասիրվում է որպես տեղային օժանդակ միջոց։ Փորձարարական հորիկում ոչնչացում ապահովող ներկանյութի խտությունը ֆիքսված կապ չունի այն խտության հետ, որը հասնում է լնդագծից ներքև գտնվող բակտերիաներին, իսկ սենյակային լույսը 660 nm դոզա չէ։ Բերանի շրջանում ցանկացած կիրառման դոզավորման, անվտանգության և փոխազդեցությունների սահմանները պետք է որոշվեն բժշկի հետ, ինչպես նշված է անվտանգության և փոխազդեցությունների տեղեկատուում։
Ինչ չի նշանակում այս ապացուցողական տվյալը
Սա կենցաղային ախտահանիչի մասին պնդում չէ։ Բակտերիցիդային աղյուսակներում օգտագործվում են որոշակի շտամներ, միջավայրեր, շփման տևողություններ, սպեկտրներ և լուսային էներգիայի մակերեսային խտություններ։ Դրանք ոչինչ չեն ասում խոհանոցային մակերեսների, օրգանական աղտոտվածության պայմաններում անհրաժեշտ շփման տևողության կամ ախտահանման կարգավորող չափանիշների մասին։
Սա նաև համակարգային հակաբիոտիկի փոխարինում չէ։ Սովորական ֆոտոդինամիկ ազդեցության համար ներկանյութը, կլանվող լույսը և թթվածինը պետք է նույն պահին լինեն նույն տեղում։ Լույսը չի հասնում խորքային կամ տարածված օջախներին այնպես, ինչպես կուլ տրված դեղը հասնում է արյան մեջ։ Գրականությունն այս մոտեցումը դիտարկում է հասանելի տեղային վարակի համար կամ որպես օժանդակ միջոց՝ ճիշտ այնպես, ինչպես Wainwright-ը սկզբից ներկայացնում էր տեղային ախտահանումը։
Հավասարակշռված ամփոփումն ավելի սահմանափակ է, բայց շարունակում է հետաքրքիր մնալ։ Մեթիլեն կապույտը մթության մեջ ունի չափավոր հակամանրէային ակտիվություն, իսկ կարմիր լույսը շատ բակտերիաների և սնկերի համար բացահայտում է շատ ավելի մեծ ֆոտոդինամիկ ազդեցություն։ Լույսի և մթության պայմանների միջև տարբերությունները կարող են մեծ լինել՝ օրինակ, Pseudomonas-ի համար 500-ից 25 uM և համաճարակային MRSA-ի համար 80-ից 20 uM, միաժամանակ առկա են ուսանելի անհաջողություններ էնտերոկոկերի և արդյունավետ արտամղման համակարգ ունեցող Candida-ի դեպքում։ Գործնական կիրառության անցումը նույնքան կախված է նյութի հասցումից, կենսաթաղանթի ֆիզիոլոգիայից և թթվածնից, որքան ներկանյութի անվանական խտությունից։ Երբ այդ պայմանները հստակ նշված են, թվերն իմաստ ունեն։ Երբ դրանք հանվում են, թվերը ոչինչ չեն նշանակում։