Ինչու է մեթիլեն կապույտն օգտագործվում որպես թթվակայուն ներկման հակադրական ներկ

Լաբորանտը ներկման ամբողջ հաջորդականությունից հետո ուսումնասիրում է խորխի քսուքը։ Կապույտ տեսադաշտում առանձնանում են կարմիր ցուպիկներ, և եզրակացության մեջ նշվում է՝ հայտնաբերվել են թթվակայուն բացիլներ։ Հաջորդ օրը մեկ այլ առարկայական ապակու վրա երևում է միատարր կապույտ տեսադաշտ՝ առանց կարմիր ցուպիկների, և արդյունքը գրանցվում է որպես տուբերկուլոզի նկատմամբ բացասական։ Այս եզրակացություններից մեկը պնդում է ավելին, քան կարելի է հիմնավորել ապակու դիտարկմամբ, և դա առաջինը չէ։

Շփոթությունը հասկացությունների մակարդակում է։ Լաբորանտը կապույտ ներկը դիտարկել է որպես հայտնաբերման քիմիական գործընթացի մաս՝ կարծես մեթիլեն կապույտն օգնում էր գտնել միկոբակտերիաները։ Այն նման դեր չի ունեցել։ Երբ մեթիլեն կապույտը հասնում է առարկայական ապակուն, փորձարկումն արդեն ավարտված է։ Ներկը միայն գունավորում է ֆոնը, որպեսզի արդյունքը հնարավոր լինի կարդալ։ Այս հոդվածը բացատրում է մեթիլեն կապույտի նպատակը թթվակայուն ներկման մեջ, թե ինչու է ընտրված կապույտը, այլ ոչ մեկ ուրիշ գույն, և ինչ եզրակացություններ է թույլ տալիս անել կապույտ ֆոնի վրա երևացող կարմիրը։

Կարճ պատասխանը

Թթվակայուն ներկումը տարբերակիչ փորձարկում է՝ հիմնված երեք գաղափարի վրա։ Հիմնական ներկը՝ կարբոլֆուքսինը, ներմուծվում է բոլոր բջիջների մեջ, այդ թվում՝ մոմանման թաղանթով միկոբակտերիաների։ Գունազրկիչը՝ թթվային սպիրտը, սովորական բջիջներից հեռացնում է կարմիր ներկը, բայց չի կարողանում այն դուրս բերել թթվակայուն բջիջներից։ Այնուհետև հակադրական ներկը՝ մեթիլեն կապույտը, գունավորում է այն ամենը, ինչից գունազրկիչը հեռացրել է ներկը։ Այդպիսով ոչ թթվակայուն բջիջները, հյուրընկալ օրգանիզմի բջիջները և մնացորդները կապույտ են երևում, իսկ թթվակայուն բացիլները մնում են կարմիր։ Հակադրական ներկը ստեղծում է հակադրություն։ Այն չի մասնակցում բջջի թթվակայունությունը պայմանավորող քիմիական գործընթացին։

Ինչ է կատարվում յուրաքանչյուր փուլում

Ստորև բերված սխեման ցույց է տալիս դերերի բաժանումը։ Ձախից աջ կարդացեք այն որպես ընթացակարգ, իսկ ներքևի շերտը՝ որպես հիշեցում, որ ներկման յուրաքանչյուր խումբ պատասխանում է տարբեր հարցի։

Առաջին փուլը ներթափանցումն է։ Միկոբակտերիաները դիմադրում են սովորական ջրային ներկերին, քանի որ նրանց թաղանթն արտասովոր հիդրոֆոբ է, ուստի ընթացակարգը ստիպում է ներկին ներթափանցել։ Ցիլ-Նիլսենի մեթոդում գոլորշի առաջացնող տաքացումը ֆենոլ պարունակող կարբոլֆուքսինը մղում է մոմանման պատի միջով։ Կինյունի սառը մեթոդում տաքացումը փոխարինվում է հիմնական ներկի շատ ավելի խիտ բաղադրությամբ, իսկ առանց տաքացման որոշ փոփոխված տարբերակներում ավելացվում են մակերևութային ակտիվ նյութեր։ Մանրէաբանության ամերիկյան ընկերության թթվակայուն ներկման ընթացակարգերը երկու բաղադրություններն էլ ներկայացնում են կողք կողքի, և խտության տարբերությունը զգալի է․ տաքացվող մեթոդի համար՝ մոտավորապես 0.3 g հիմնային ֆուքսին՝ 100 mL-ում, իսկ սառը մեթոդի համար՝ մոտ 4 g։

Երկրորդ փուլը տարբերակումն է։ Թթվային սպիրտը, որը սովորաբար պարունակում է 3 mL խտացված աղաթթու՝ 97 mL 95 տոկոսանոց էթանոլում, կարմիր ներկը լվանում է բոլոր այն բջիջներից, որոնց պատը հատուկ դիմադրություն չի ցուցաբերում։ Միկոբակտերիաներին բնորոշ ամբողջական լիպիդային թաղանթ ունեցող բջիջները պահպանում են ներկը։ Ամբողջ մեթոդը հիմնված է այս փուլի վրա, և հենց այս փուլն է առավել զգայուն կատարման տեխնիկայի նկատմամբ, ինչպես քննարկվում է ստորև։

Վերջին փուլը հակադրության ստեղծումն է։ Այժմ առարկայական ապակու վրա կան կարմիր թթվակայուն բջիջներ՝ ներկը կորցրած բջիջներից կազմված գրեթե անգույն ֆոնի վրա։ 0.3 տոկոս w/v մեթիլեն կապույտը վերականգնում է այդ ֆոնի տեսանելիությունը՝ կարմիրից առավել տարբերվող գույնով։ Հակադրական ներկումը կարճատև է՝ սովորաբար 20-ից 30 վայրկյան տաքացվող մեթոդում և մինչև մի քանի րոպե սառը մեթոդի որոշ տարբերակներում։ Տևողությունը կախված է ընթացակարգից, ոչ թե հենց ներկի հատկություններից։

Ինչու հենց այս ներկը, և ինչու կապույտ

Մեթիլեն կապույտը կատիոնային հիմնային ներկ է․ այսինքն՝ նրա գունավոր իոնը կրում է դրական լիցք և կապվում է գունազրկված բակտերիաների, հյուրընկալ օրգանիզմի բջիջների ու մնացորդների բացասական լիցքավորված մակերեսներին։ OpenStax-ի «Մանրէաբանություն» դասագիրքը լիցքերի այս փոխազդեցությունը նկարագրում է որպես հիմնային ներկերի գործողության ընդհանուր սկզբունք։ Սակայն այստեղ մեթիլեն կապույտը քիմիական առումով եզակի չէ։ Բյուրեղային մանուշակագույնը և սաֆրանինը նույնպես հիմնային ներկեր են։ Ընտրությունը օպտիկական է, ոչ թե քիմիական։

Կարմիր ցուպիկների համար անհրաժեշտ է հակադրվող երանգով ֆոն, իսկ լուսավոր դաշտի մանրադիտակման համար կապույտը կարմիրին հակադրվում է առավել օգտակար ձևով։ Սաֆրանինը վատ հակադրական ներկ կլիներ, քանի որ նրա վերջնական վարդագույն-կարմիր երանգը չափազանց մոտ է պահպանված կարբոլֆուքսինի գույնին՝ վերացնելով հենց այն տարբերությունը, որը ստեղծել էր ընթացակարգը։ Բյուրեղային մանուշակագույնը կտար մուգ մանուշակագույն ֆոն, որը բարակ կարմիր բացիլների հետ կմրցեր դիտողի ուշադրության համար։ Ամենահամոզիչ ապացույցը, որ խնդիրը հակադրությունն է, այլ ոչ քիմիան, փոխարինման հնարավորությունն է․ որոշ անասնաբուժական և փոփոխված ընթացակարգերում օգտագործվում են կանաչ հակադրական ներկեր, օրինակ՝ մալաքիտային կանաչը և ադամանդային կանաչը, ու փորձարկումը շարունակում է գործել, քանի որ ցանկացած հստակ տարբերվող երանգ կատարում է նույն դերը։

Այստեղից բխում են երկու գործնական հետևություն։ Նախ՝ ստանդարտ բաղադրատոմսը pH-ի ճշգրտում չի նախատեսում։ Այս պարզ ջրային 0.3 տոկոսանոց լուծույթը մի շփոթեք հիմնային բաղադրությունների հետ, օրինակ՝ Լյոֆլերի մեթիլեն կապույտի, որոնք պատկանում են ներկման այլ մոտեցման։ Երկրորդ՝ չափից ավելի ներկելը վնասում է։ Հյուսվածաբանության գրականությունը հատուկ զգուշացնում է, որ չափազանց խիտ կապույտ ֆոնը կարող է քողարկել սակավաթիվ բացիլները։ Հետևաբար ապակին ընթացակարգով թույլատրվածից ավելի երկար ներկի տակ պահելը նվազեցնում է ընթեռնելիությունը՝ առանց որևէ օգուտի։

Բջջապատի քիմիան, որը հնարավոր է դարձնում փորձարկումը

Թթվային սպիրտի տարբերակող ազդեցության պատճառը միկոբակտերիայի թաղանթի կառուցվածքն է։ Դրա կառուցվածքային հիմքը միկոլիլ-արաբինոգալակտան-պեպտիդոգլիկան համալիրն է․ պեպտիդոգլիկանը կապված է արաբինոգալակտանին, որի արտաքին ծայրերը կրում են շատ երկար շղթաներով միկոլաթթուներ՝ ձևավորելով լիպիդներով հարուստ արտաքին միկոթաղանթ՝ արտասովոր ցածր թափանցելիությամբ։ Միկոբակտերիաների արտաքին թաղանթի մասին ակնարկը մանրամասն նկարագրում է այս կառուցվածքը։ Պատնեշը գործում է երկու ուղղությամբ։ Այն դիմադրում է ներկի ներթափանցմանը, ինչի պատճառով անհրաժեշտ են տաքացում կամ ավելի խիտ հիմնական ներկ, և դիմադրում է ներկի դուրսբերմանը, ինչի պատճառով թթվային սպիրտը չի կարողանում հեռացնել արդեն ներսում գտնվող կարբոլֆուքսինը։ Սովորական բակտերիաները չունեն այս թաղանթը և կորցնում են ներկը։ Ուստի թթվակայունությունն ավելի ճիշտ է հասկանալ որպես լիպիդային պատնեշով պայմանավորված երևույթ, ոչ թե ֆուքսինի քիմիական կապում միկոլաթթվին։

Այս քիմիան բացատրում է նաև հաճախ հանդիպող մի տարակուսանք․ միկոբակտերիաները Գրամի մեթոդով ներկվում են վատ և անկանխատեսելի կերպով՝ երբեմն երևալով որպես թույլ ներկված հատիկավոր ձևեր կամ չներկված ուրվապատկերներ։ Նրանց հիդրոֆոբ պատը սահմանափակում է բյուրեղային մանուշակագույնի ներթափանցումը։ Թթվակայուն ներկումը Գրամի ներկման փոփոխված տարբերակ չէ։ Այն տարբերակման այլ սկզբունք է՝ հիմնված բջջապատի մեկ այլ հատկության վրա, ինչպես մյուս երկու մեթոդների համար ցույց է տալիս պարզ ներկման և Գրամի ներկման համեմատությունը։

Երեք մեթոդ, երեք հարց

Մեկ ներկով բակտերիաների ներկման մեթոդների ավելի լայն խմբի մասին տե՛ս մանրադիտակային ներկման ատլասը։

Ինչ չի կարող ապացուցել կապույտ ֆոնի վրա կարմիրը

Կարմիր ցուպիկները նշանակում են, որ միկրոօրգանիզմները պահպանել են կարբոլֆուքսինը թթվային սպիրտի ազդեցությունից հետո։ Այդ պատկերը համապատասխանում է Mycobacterium tuberculosis-ին, սակայն CDC-ի տուբերկուլոզի ախտորոշման ուղեցույցը հստակ նշում է, որ այլ միկոբակտերիաներ նույնպես թթվակայուն են։ Ուստի տեսակային նույնականացման համար անհրաժեշտ են ցանք և նուկլեինաթթուների հետազոտություն, ոչ թե գույն։

Տեխնիկական սխալները հիմնականում կապված են լվացման երկու փուլերի հետ։ Անբավարար գունազրկումը ֆոնային նյութը թողնում է կարմիր և կարող է հանգեցնել կեղծ դրական մեկնաբանությունների։ Չափից ավելի գունազրկումը հեռացնում է թույլ պահվող հիմնական ներկը և նպաստում կեղծ բացասական արդյունքներին։ Չափից ավելի ինտենսիվ հակադրական ներկումը սակավաթիվ բացիլները թաքցնում է կապույտի մեջ։ Հաստ քսուքները, նստվածք առաջացրած ռեագենտները և աղտոտված լվացման ջուրը նույնպես առաջացնում են իրենց բնորոշ արտեֆակտները։

Զգայունությունը սահմանափակվում է միկրոօրգանիզմների քանակով՝ անկախ կատարման տեխնիկայի որակից։ Սովորական քսուքի մանրադիտակման համար անհրաժեշտ է մոտավորապես 5,000-ից 10,000 բացիլ՝ խորխի մեկ միլիլիտրում։ CDC-ի ավելի վաղ ապացույցների ակնարկներում քսուքի զգայունությունը ցանքով հաստատված թոքային դեպքերում գնահատվել է մոտ 45-ից 80 տոկոս։ Հետևաբար բացասական քսուքը երբեք չի բացառում տուբերկուլոզը։ CDC-ի ներկայիս ուղեցույցը նախատեսում է ցանք յուրաքանչյուր քսուքի հետ միասին և խորհուրդ է տալիս նուկլեինաթթուների ամպլիֆիկացման հետազոտություն կատարել առնվազն մեկ շնչառական նմուշի վրա, երբ ենթադրվում է թոքային տուբերկուլոզ, և արդյունքը կփոխի հետագա վարումը։

Գործնական աշխատանքը պետք է կատարվի հաստատված ընթացակարգերով

Ուսուցողական նկարագրությունները, այդ թվում՝ այս հոդվածը, կլինիկական աշխատանք կատարելու թույլտվություն չեն տալիս։ Լաբորատոր աշխատանքի համար հետևեք լաբորատորիայի վավերացված ստանդարտ գործառնական ընթացակարգին՝ համապատասխանեցված CDC-ի, APHL-ի կամ CLSI-ի գործող փաստաթղթերին։ CDC-ի Stacks արխիվում պահվող թթվակայուն ներկման տեղեկատուն ցույց է տալիս, թե ինչպես են նման ընթացակարգերը սահմանում ռեագենտներն ու արդյունքների գնահատումը։ Տուբերկուլոզի նմուշների հետ աշխատանքը պահանջում է կենսաբանական մեկուսացման միջոցներ․ քսուքները պատրաստվում են կենսաբանական անվտանգության պահարանում, քանի որ պատրաստման ընթացքում առաջանում են աերոզոլներ և ցայտքեր։ CDC-ի լաբորատոր անվտանգության ուղեցույցը նշում է, որ նույնիսկ ջերմությամբ ֆիքսված քսուքները կարող են պարունակել կենսունակ տուբերկուլոզային բացիլներ և պետք է շարունակեն մշակվել որպես վարակված նյութ։ CDC-ի Հանրային առողջության պատկերադարանի գրառումը՝ կարբոլֆուքսինով և մեթիլեն կապույտով ներկված, M. leprae-ի հայտնաբերման համար ուսումնասիրված քսուքի մասին, օգտակար հիշեցում է, որ մեթոդի կիրառությունը չի սահմանափակվում տուբերկուլոզով։ Կապույտ ֆոնի վրա նույն կարմիր հակադրությունը կիրառվում է ամենուր, որտեղ փնտրվում են թթվակայուն միկրոօրգանիզմներ, իսկ ուշադիր դիտարկմամբ ստացված բացասական արդյունքն ինքնին արժանի է գրանցման։

Պատրաստի ապակու գնահատումը

Հակադրական ներկի օգտակարությունն ակնհայտ է նախնական զննման ժամանակ։ Փոքր խոշորացմամբ դիտող մանրադիտակաբանը նախ կապույտ ֆոնն օգտագործում է քսուքի որակը գնահատելու համար՝ բջիջների հավասարաչափ բաշխում, ֆոկուսավորման համար ամբողջական հյուրընկալ բջիջներ, առատ նստվածքի բացակայություն։ Այնուհետև կարմիր կասկածելի տարրերը գրավում են ուշադրությունը հենց այն պատճառով, որ ապակու վրա ուրիշ ոչինչ կարմիր չէ։ Հաստատումը կատարվում է յուղային իմերսիայի պայմաններում, որտեղ իրական բացիլները ցուցադրում են սպասվող բարակ, երբեմն թեթևակի կոր կամ հատիկավոր ցուպիկների տեսքը՝ ի տարբերություն միատարր ներկային մնացորդների։

Ֆոնի ներկումը նաև որոշում է եզրակացության ձևակերպումը։ Կարմիր բացիլներով ապակու արդյունքը գրանցվում է որպես «հայտնաբերվել են թթվակայուն բացիլներ»՝ հաճախ լաբորատորիայի սանդղակով կիսաքանակական գնահատմամբ։ Եթե ապակու վրա կարմիր միկրոօրգանիզմներ չեն երևում, արդյունքը գրանցվում է որպես «թթվակայուն բացիլներ չեն հայտնաբերվել», երբեք՝ «տուբերկուլոզի նկատմամբ բացասական»։ Այս տարբերությունը կարևոր է, քանի որ կապույտ տեսադաշտը հաստատում է, որ ներկումն աշխատել է, բջիջները կլանել են հակադրական ներկը, և օպտիկական պայմանները բավարար են եղել։ Սակայն այն ոչինչ չի ասում հայտնաբերման սահմանից ցածր քանակով միկրոօրգանիզմների մասին։ Առանց կարմիր տարրերի կապույտ տեսադաշտը վավեր արդյունք է տվյալ ապակու վերաբերյալ, ոչ թե հիվանդի մասին վերջնական եզրակացություն։

Հիշեք դերերի բաժանումը, և եզրակացությունների ձևակերպումը պարզ կդառնա։ Կարբոլֆուքսինը հայտնաբերում է կասկածելի միկրոօրգանիզմները։ Թթվային սպիրտը կատարում է փորձարկումը։ Մեթիլեն կապույտը միայն պատասխանը դարձնում է ընթեռնելի․ կարմիրը պահպանել է ներկը թթվի ազդեցության պայմաններում, կապույտը՝ կորցրել այն։ Մնացած ամեն ինչ՝ տեսակը, միկրոօրգանիզմների քանակը և կլինիկական նշանակությունը, պարզվում է առարկայական ապակու դիտարկումից դուրս կատարվող աշխատանքով։