Լյոֆլերի հիմնային և պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտ ներկանյութերի բացատրությունը

Ներկման սեղանին կարող են կողք կողքի դրված լինել երեք շիշ, որոնցից յուրաքանչյուրի պիտակին նշված է մեթիլենային կապույտի որևէ տարբերակ։ Մեկի վրա գրված է՝ ջրային մեթիլենային կապույտ 1%։ Մյուսի վրա՝ Լյոֆլերի հիմնային մեթիլենային կապույտ։ Երրորդի վրա՝ պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտ։ Զբաղված աշխատակիցը վերցնում է ամենամոտ շիշը։ Այնուհետև քսուքը ներկվում է չափազանց թույլ, չափազանց միատարր կապույտով կամ մանուշակագույնի անսպասելի երանգներով, իսկ արդյունքի պատճառը վերագրվում է նմուշին։

Սա լուծույթի բաղադրության խնդիր է, ոչ թե նմուշի։ Երեք լուծույթները պարունակում են հարակից ներկանյութեր, բայց հիմնված են ներկման տարբեր մոտեցումների վրա։ Մեկը սովորական կատիոնային ներկանյութ է՝ գրեթե չեզոք pH-ով։ Մյուսը նույն ներկանյութն է, որի ազդեցությունն ուժեղացվել է հիմքով։ Երրորդն այլևս մեկ ներկանյութ չէ, այլ կանխամտածված օքսիդացմամբ ստացված խառնուրդ։ Սխալ տարբերակն օգտագործելու դեպքում ձեր աշխատանքի ընթացքում փոխվում է ներկման սկզբունքը։

Կարճ պատասխանը

Սովորական ջրային մեթիլենային կապույտը ելակետային տարբերակն է՝ մոտ 1% ներկանյութ ջրում, պարզ կատիոնային ներկանյութ՝ բակտերիաների ձևաբանության ուսումնասիրության և ընդհանուր մանրադիտակային հետազոտությունների համար։ Լյոֆլերի հիմնային մեթիլենային կապույտը ստացվում է ջրով նոսրացված սպիրտային մայր լուծույթին նոսր հիմքի փոքր, չափված քանակ ավելացնելով։ Դա բարձրացնում է pH-ը և ուժեղացնում կատիոնային ներկանյութի կապումը բակտերիաների թթվային կառուցվածքներին։ Պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտը մեթիլենային կապույտ է, որը կանխամտածված հասունացվել է հիմնային միջավայրում օքսիդացմամբ։ Ուստի շիշը պարունակում է դեմեթիլացված հոմոլոգների՝ azure A-ի, azure B-ի, azure C-ի, թիոնինի և մեթիլենային մանուշակագույնի խառնուրդ՝ մնացորդային մեթիլենային կապույտի հետ միասին, և այդ խառնուրդը տարբեր կառուցվածքները ներկում է տարբեր երանգներով։

Եթե հիշելու եք միայն մեկ նախադասություն, ապա սա է՝ հիմնայնացումը փոխում է ներկման ինտենսիվությունը, իսկ պոլիքրոմացումը՝ ներկման գույները։

Սովորական ջրային մեթիլենային կապույտը՝ համեմատության ելակետ

Ամենապարզ բաղադրությունը ջրում լուծված մեթիլենային կապույտն է, սովորաբար՝ 1% w/v խտությամբ, առանց հիմքի և առանց օքսիդացման։ Գունավոր քիմիական մասնիկը մեթիլթիոնինիումի կատիոնն է՝ քլորիդ հակաիոնով։ Այն փոքր, հարթ ֆենոթիազինային ներկանյութ է, որը PubChem-ի՝ մեթիլենային կապույտի գրառման մեջ նկարագրված է որպես մեթիլթիոնինիումի քլորիդ։ Որպես կատիոն՝ այն կապվում է նուկլեինաթթուների ֆոսֆատային կմախքին և բակտերիաների բջջապատերի թթվային խմբերին՝ բաց ֆոնի վրա բջիջները ներկելով կապույտ։

Դրա առավելությունը կանխատեսելիությունն է։ Կորիզներն ու բակտերիաները երևում են կապույտ։ Հակադրությունը չափավոր է։ Թույլ տեսանելի միկրոօրգանիզմները կարող են թույլ ներկվել, և հենց այս սահմանափակումն էր Լյոֆլերը փորձում հաղթահարել։ Բակտերիաների պարզ ներկանյութերի ավելի լայն խմբի մասին, որին պատկանում է այս լուծույթը, տես բակտերիաների պարզ ներկման ընդհանուր նկարագրությունը։ Այստեղ ևս կարևոր է ներկանյութի ինքնության ճշգրիտ ստուգումը․ մեթիլային կապույտը բոլորովին այլ մոլեկուլ է, ինչպես բացատրված է մեթիլային կապույտի և մեթիլենային կապույտի համեմատության մեջ, ուստի կատալոգում միայն գույնի անվամբ որոնումը կարող է հանգեցնել ներկանյութի սխալ դասի ընտրությանը։

Լյոֆլերի հիմնային մեթիլենային կապույտը՝ նույն ներկանյութը, ավելի ուժեղ ազդեցությամբ

Լյոֆլերի դասական բաղադրատոմսը միավորում է մեթիլենային կապույտի սպիրտային մայր լուծույթը և ջրում նոսրացված հիմքը։ Դասագրքային տարբերակները նախատեսում են 0.3 g ներկանյութ՝ 30 mL 95% էթանոլում, գումարած 100 mL 0.01% կալիումի հիդրօքսիդի ջրային լուծույթ։ Համարժեք տարբերակն է 30 mL մեթիլենային կապույտի հագեցած սպիրտային լուծույթ, 100 mL թորած ջուր և 1 mL 1% KOH։ Արդյունքում ստացվում է մոտ 0.3% ներկանյութ պարունակող աշխատանքային լուծույթ՝ հստակ հիմնային pH-ով։ Առևտրային տարբերակները հետևում են նույն սկզբունքին, իսկ Thermo Fisher-ի մանրէաբանական ներկանյութերի կատալոգում Լյոֆլերի հիմնային մեթիլենային կապույտը պոլիքրոմ և ջրային տարբերակների կողքին ներկայացված է որպես առանձին ապրանք՝ առանձին նախատեսված կիրառություններով։

Հիմքի ավելացումն այստեղ առանցքային գաղափարն է։ pH-ի բարձրացումը նմուշի կարբօքսիլային և ֆոսֆատային խմբերից հեռացնում է պրոտոնները՝ մեծացնելով բացասական լիցքավորված տեղամասերի խտությունը։ Միաժամանակ սպիրտային մայր լուծույթը ներկանյութը պահում է ամբողջությամբ լուծված վիճակում, որպեսզի այն այդ տեղամասերին հասնի մոնոմերային ձևով։ Արդյունքում բակտերիաները ներկվում են ավելի արագ և ավելի ինտենսիվ, քան չեզոք ջրային ներկանյութով՝ առաջացնելով սովորական մանրէաբանական քսուքին բնորոշ մուգ կապույտ ցուպիկներ և կոկեր։ Ներկումը սովորաբար տևում է մեկից երեք րոպե, որից հետո նմուշը ողողվում է ջրով։

Դասական կիրառությունը Լյոֆլերի շիճուկային միջավայրում աճեցված Corynebacterium diphtheriae-ն է՝ բարակ, հաճախ գուրզանման ցուպիկներ, որոնք պարունակում են կուտակված պոլիֆոսֆատի՝ Բաբեշ–Էռնստի ուժեղ ներկվող մետաքրոմատիկ հատիկներ։ Միջավայրի և ներկանյութի այս զուգակցումը պատմական է․ երկուսն էլ վերագրվում են նույն մանրէաբանին, իսկ հատիկների հակադրությունը դրա ախտորոշիչ առավելությունն է։ Դիֆթերիայի հետ կապված աշխատանքներից բացի, ներկանյութը կիրառվում է որպես ընդհանուր մանրէաբանական ներկանյութ՝ կուլտուրաներից պատրաստված քսուքների, կլինիկական քսուքներում Neisseria-ի ձևաբանության ուսումնասիրության համար և այն դեպքերում, երբ Գրամի ներկումն անհրաժեշտ չէ, բայց սովորական ջրային կապույտը չափազանց թույլ է ներկում։ Սա միագույն ներկանյութ է։ Բոլոր թթվային կառուցվածքները ստանում են կապույտի որևէ երանգ։ Երբ ընթացակարգը պահանջում է գունային տարբերակում, միայն հիմքը չի կարող ապահովել այն։

Գործնական մեկ զգուշացում․ հիմնային ներկանյութերի լուծույթները պահպանման և ածխաթթու գազի կլանման ընթացքում քայքայվում են և նստվածք առաջացնում։ Լաբորատորիաները կամ պատրաստում են փոքր ծավալներ, կամ գնում են կատալոգային լուծույթը և հետևում դրա պահպանման ժամկետին՝ հին շիշը շարունակ օգտագործելու փոխարեն, որն արդեն յուրաքանչյուր առարկայական ապակու վրա նստվածք է թողնում։

Պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտը՝ մեկ անուն, մի քանի ներկանյութ

Պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտի ստացումը սկսվում է նույն ներկանյութից, որը հիմնային միջավայրում ենթարկվում է վերահսկվող օքսիդացման։ Պատմականորեն այս գործընթացը կոչվել է հասունացում կամ պոլիքրոմացում։ Հիմնային միջավայրում հնեցումը, կարբոնատով տաքացումը կամ երկքրոմատի նման նյութերով օքսիդացումը դիմեթիլամինային տեղակալիչներից փուլ առ փուլ հեռացնում են մեթիլային խմբերը։ Ստացվում է խառնուրդ՝ մնացորդային մեթիլենային կապույտ, azure B՝ մեկ մեթիլային խմբի կորստով, azure A և azure C՝ հետագա դեմեթիլացմամբ, թիոնին՝ ամբողջությամբ դեմեթիլացված, և մեթիլենային մանուշակագույնի խմբի օքսիդացման կողմնակի արգասիքներ։ Յուրաքանչյուր բաղադրիչ ունի իր երանգը և հյուսվածքների նկատմամբ կապակցման հակումը, ուստի խառնուրդը ներկում է մետաքրոմատիկ կերպով․ կորիզները, հատիկները, մուցինները և աճառը ստանում են տարբեր երանգներ՝ կապույտից մինչև կարմրամանուշակագույն։

Այս քիմիական գործընթացներն են նաև հայտնի արյան ներկանյութերի հիմքում։ Վաղ հետազոտողները պարզել էին, որ հիմնայնացված մեթիլենային կապույտը մալարիայի մակաբույծի կորիզները ներկում է մանուշակագույնի երանգներով, սակայն նրանց հասունացված ջրային լուծույթներն անկայուն էին և մի քանի օրվա ընթացքում նստվածք էին առաջացնում։ Արյան մանուշակագույն ներկանյութի ստեղծման պատմության ակնարկը նկարագրում է, թե ինչպես Մալախովսկին և Ռոմանովսկին 1891 թվականին միմյանցից անկախ կիրառեցին այս ազդեցությունը, ինչպես ներմուծվեց մեթանոլը՝ ներկանյութի նստվածքը կայունացնելու և քսուքներն առանց տաքացման ֆիքսելու համար, և ինչպես Գիմզան հետագայում ստանդարտացրեց խառնուրդը՝ հիմք ընդունելով azure B-ի չափված քանակը և էոզինը՝ գլիցերինով կայունացմամբ։ Ժամանակակից Գիմզայի տիպի ներկանյութերն ուղղակիորեն ծագում են պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտի և էոզինի համակցությունից, որն առաջացնում է Ռոմանովսկու էֆեկտը։ Էոզինի հետ զուգակցման և azure B բաղադրիչի մանրամասների համար տես Ռոմանովսկու տիպի ներկանյութերը և azure B-ի ու էոզինի փոխազդեցությունը։

Քանի որ պոլիքրոմ մեթիլենային կապույտը խառնուրդ է, իր բնույթով այն երեք տարբերակներից ամենաքիչ ստանդարտացվածն է։ Դրա երանգների ճշգրիտ հավասարակշռությունը կախված է օքսիդացման եղանակից և աստիճանից։ Այդ պատճառով հյուսվածաբանական նյութերի մատակարարներն այն վաճառում են որպես առանձին արտադրանք՝ կիրառական հատկությունների սեփական փորձարկումներով, այլ ոչ որպես հնեցված Լյոֆլերի լուծույթ։ Սովորական կիրառությունները ներառում են պարարտ բջիջների հատիկների, մուցինների և աճառի մետաքրոմատիկ ցուցադրումը, պլազմային բջիջների մանրամասների արտահայտումը և հյուսվածքային կտրվածքներում Helicobacter pylori-ի ցուցադրումը՝ Գուդպասչերի տիպի պոլիքրոմ մեթոդներով։ Սա ճիշտ ընտրությունն է, երբ խնդիրը գույնով տարբերակումն է, և սխալ ընտրություն՝ երբ ընթացակարգը պահանջում է բակտերիայի հստակ միագույն ուրվապատկեր։

Բաղադրության և նշանակության համեմատություն

Աղյուսակն օգտագործեք որպես ընտրության ուղեցույց։ Եթե նմուշը չափազանց թույլ է ներկվում, փոխեք pH-ի վրա հիմնված մոտեցումը և ընտրեք Լյոֆլերի լուծույթը։ Եթե ամեն ինչ ներկվում է, բայց ոչինչ չի առանձնանում, փոխեք ներկանյութի տեսակը և ընտրեք պոլիքրոմը։ Եթե Լյոֆլերով ներկված քսուքում հատիկները հիանալի են երևում, բայց ղեկավարը հարցնում է, թե ինչու կորիզներն ու ցիտոպլազման նույն կապույտն ունեն, պատասխանն այն է, որ ոչ մի հիմնային միագույն ներկանյութ չի կարող կատարել գունային տարբերակման այդ խնդիրը։ Այդ խնդիրը վերաբերում է պոլիքրոմ խմբին և դրա արյան ներկանյութերի ածանցյալներին։

Ինչպես խուսափել սովորական շփոթություններից

Շփոթության մեծ մասը պայմանավորված է երկու սխալով։ Առաջինը Լյոֆլերի լուծույթը սովորական մեթիլենային կապույտի հետ փոխարինելի համարելն է, քանի որ շշի մեջ երկուսն էլ կապույտ են երևում։ Դրանք տարբերվում են pH-ով և ներկման ինտենսիվությամբ, և այնտեղ, որտեղ նշված է Լյոֆլերի լուծույթը, չեզոք ներկանյութով փոխարինելը վերացնում է հենց այն հատիկային հակադրությունը, որի համար մշակվել է ընթացակարգը։ Երկրորդը ցանկացած հին կամ պատահաբար հնեցված հիմնային կապույտը պոլիքրոմ համարելն է։ Չվերահսկվող հնեցումն առաջացնում է անհայտ խտությամբ անհայտ խառնուրդ, մինչդեռ իսկական պոլիքրոմ լուծույթները պատրաստվում են սահմանված օքսիդացման եղանակներով, իսկ արյան ներկանյութերի շարքում համակցվում են էոզինի չափված քանակի հետ։ Պատմությունն այստեղ ուսանելի է․ 1890-ականների անկայուն հասունացված ջրային լուծույթները փոխարինվեցին մեթանոլային կայունացված բաղադրություններով հենց այն պատճառով, որ չվերահսկվող խառնուրդները հնարավոր չէր վերարտադրել։ Այս դասը արժե հիշել նախքան անորոշ տարիքի շշից վերցված լուծույթով ախտորոշիչ ապակի ներկելը։

Անվանումների ճշգրիտ ստուգումն ամբողջացնում է այս մոտեցումը։ Պիտակի վրա հաստատեք կատալոգային ապրանքի տեսակը՝ ջրային, Լյոֆլերի կամ պոլիքրոմ, ներկանյութի պարունակությունը և նախատեսված կիրառությունը՝ դրանք գույնից ենթադրելու փոխարեն։ Երեք բաղադրություններն ունեն ընդհանուր սկզբնական քրոմոֆոր։ Բայց դրանք նույն նշանակությունը չունեն։