A nagyobb oxigénfogyasztás több ATP-t jelent? A metilénkékkel végzett vizsgálatok tanulságai

Egy izolált mitokondrium energiaforrást tartalmazó, de ADP nélküli kamrában van. Lassan fogyasztja az oxigént. ADP hozzáadására az oxigénfogyasztás többszörösére ugrik. Ha megvárjuk, amíg az ADP elfogy, az oxigénfogyasztás visszaesik. Az energiaforrás nem változott. Csak az ATP iránti igény.

Ez a rövid eseménysor magában foglalja azt a különbséget, amelyről ez a cikk szól. Az oxigénfogyasztás azt méri, milyen gyorsan áramlanak az elektronok a légzési láncon át az oxigénhez. Az ATP-termelés azt méri, hogy ennek az áramlásnak mekkora része rögzül felhasználható energiaként. A kettőt egy köztes lépés, a belső mitokondriális membrán két oldala közötti protongradiens köti össze. Bármi, ami megváltoztatja, mennyire szorosan kapcsolódik ez a gradiens az ATP-szintézishez, eltérő irányba mozdíthatja a két végpontot. A metilénkék jól szemlélteti ezt, mert mindkét viselkedését megfigyelték már: egyes preparátumokban az ATP-vel együtt növelte az oxigénfelhasználást, másokban pedig úgy fokozta azt, hogy közben az ATP változatlan maradt vagy csökkent.

Aki először az elektrontovábbítás tágabb képét szeretné megismerni, kezdheti azzal, hogyan szállítja a metilénkék az elektronokat a légzési láncon keresztül. A korai oxigénkísérletek fogalmai iránt érdeklődők pedig elolvashatják, mit mutattak valójában az első légzésmérések.

A légzés, az ATP és a köztük lévő gradiens

A NADH és a FADH2 elektronjai az I. és a II. komplexnél lépnek be a láncba, a III. komplexen át a citokróm c-hez jutnak, majd a IV. komplexen keresztül az oxigénhez. Az I., a III. és a IV. komplexnél felszabaduló energia protonokat pumpál a mátrixból az intermembrán térbe. A töltés és a savasság ilyen elkülönülése hozza létre a protonhajtó erőt, amelynek elektromos összetevője, a membránpotenciál rendszerint a meghatározó rész.

Az ATP-szintáz visszaengedi a protonokat a mátrixba, és a felszabaduló energiát arra használja, hogy ADP-ből és foszfátból ATP-t hozzon létre. A folyamat tehát:

oxigénfogyasztás, majd protonpumpálás, majd gradiens, végül ATP-szintézis.

A bökkenő az, hogy a protonok más útvonalakon is visszatérhetnek. Minden olyan visszaáramlás, amely megkerüli az ATP-szintázt, protonszivárgás. A szivárgás arra kényszeríti a láncot, hogy ugyanazokat a protonokat újra kipumpálja a membránpotenciál fenntartásához. Ez több oxigént fogyaszt anélkül, hogy több ATP keletkezne. A kellően erős szivárgás szétkapcsolást jelent: az oxigénfelhasználás nő, miközben az ATP változatlan marad vagy csökken, az elpazarolt energia pedig hőként távozik.

A 3-as állapot, a 4-es állapot és a légzési kontrollhányados

Az ehhez használt klasszikus fogalomrendszer az izolált mitokondriumok vizsgálatából származik. A 3-as állapot a szubsztrát és ADP jelenlétében zajló légzés: az ATP-szintáz csökkenti a gradienst, a membránpotenciál visszaesik, a lánc felgyorsul annak helyreállítására, és az oxigénfelhasználás magas, mert ATP képződik. A 4-es állapot az ADP elfogyása utáni légzés: az ATP-szintáz tétlen, a gradiens nő, a magas membránpotenciál akadályozza a további pumpálást, az oxigénfelhasználás pedig a szivárgás ellensúlyozásához szükséges szintre csökken.

A légzési kontrollhányados, vagyis a 3-as állapot légzési sebessége osztva a 4-es állapotéval, ezért azt jelzi, mennyire szorosan kapcsolt a preparátum működése. A magas hányados azt jelenti, hogy az ADP erősen szabályozza a légzést. Ha a hányados csökken, miközben a 4-es állapot légzése nő, akkor a szivárgás kerül előtérbe. Ezen a szemüvegen keresztül válnak érthetővé az alábbi metilénkék-eredmények.

Egy gondolati modellt érdemes megjegyezni. A magas membránpotenciál lassítja a láncot. A potenciál leépítése felgyorsítja. A lánc arra reagál, mennyire nehézzé vált a pumpálás, nem közvetlenül arra, hogy termelődik-e ATP.

Amikor a végpontok együtt változnak

A kapcsolt működés legegyértelműbb példáját a gátolt légzési komplexekkel rendelkező, izolált tengerimalac-agyi mitokondriumok adják. 100 nanomoláris és 1 mikromoláris közötti metilénkék-koncentrációnál a nyugalmi oxigénfogyasztás nőtt, ha az energiaforrás glutamát és malát, szukcinát vagy glicerofoszfát volt, miközben az ADP által serkentett légzés változatlan maradt. Az I. vagy a III. komplexnél mérgezett mitokondriumokban a festék mérsékelten növelte az ATP-termelést, helyreállította a membránpotenciált és javította a kalciumfelvételt. A feltételezett útvonal egy kerülőút: a festék a gátlás helye előtt vesz fel elektronokat, majd a citokróm c-nek adja át őket, megkerülve a károsodott komplexet.

A második, együtt járó változást mutató esetben az ATP teljesen más forrásból származik. A gátolt ATP-szintázzal rendelkező, izolált agyi mitokondriumokban a metilénkék továbbra is serkentette a légzést minden vizsgált szubsztrát mellett. Az ATP-szintézis azonban csak alfa-ketoglutarát és glutamát mellett nőtt, vagyis annál a két szubsztrátnál, amelyből szukcinil-CoA képződik. Mivel az oligomicin gátolta az ATP-szintázt, a többlet-ATP a citromsavciklusban, a szukcinil-CoA-ligáz által végzett szubsztrátszintű foszforilációból származott, nem oxidatív foszforilációból. A festék akkor is helyreállította a membránpotenciált, amikor az I. komplexet és az ATP-szintázt egyszerre gátolták. Itt az oxigénfelhasználás és az ATP együtt nőtt, de csak akkor, ha a szubsztrát lehetővé tette a második ATP-termelő útvonal működését. Szukcinát vagy malát mellett a légzés többlet-ATP nélkül fokozódott. Ugyanaz a festék, ugyanaz a kamra, más energiaforrás, más eredmény.

Amikor a végpontok eltérően változnak

Az eltérő változást mutató esetek ugyanúgy publikáltak és ugyanannyira tanulságosak. Egy izolált patkánymáj-mitokondriumokon végzett, 1997-es vizsgálatban a metilénkék felgyorsította a 4-es állapot légzését a szorosan kapcsolt, szukcinátot felhasználó mitokondriumokban, ami csökkentette a légzési kontrollhányadost. A hatás már 0.5 mikromoláris koncentrációtól látható volt, és 5 mikromolárisnál erőteljessé vált; ez utóbbi koncentráció közel áll a 100 milligrammos intravénás bolus után kialakuló plazmaszintekhez. 5 mikromolárisnál a mitokondriumok meg is duzzadtak, bár a kapcsolás zavara már alacsonyabb koncentrációknál megjelent. Ez arra utal, hogy a szivárgás megelőzte a szerkezeti károsodást, nem pedig abból eredt. A szétkapcsolt mitokondriumokban a festék telíthető, koncentrációfüggő módon serkentette a légzést. Az oxigénfelhasználás mindkét preparátumban nőtt. Az elfogyasztott oxigénre jutó ATP-szintézis nem. Ez a szétkapcsolás és az elektronszállítás tankönyvi példája, ugyanabban a molekulában.

A legszembetűnőbb eltérés a retinából származik. AIF-hiányos egerekben és rotenonnal kezelt fotoreceptorsejtekben a metilénkék megőrizte a retina vastagságát, a fotoreceptorok markereit és a mitokondriális szerkezetet. Emellett csökkentette a NADH/NAD arányt és mérsékelte a stresszválasz-útvonalak aktivitását, köztük a nem megfelelően feltekeredett fehérjékre adott választ és a mitofágiát. Mindezt az ATP-hiány korrigálása nélkül tette. Az energia helyreállítása nélküli védelem azt jelenti, hogy az előny a redoxegyensúlyon és a mitokondriumok épségén keresztül érvényesült, nem többlet-ATP révén. Aki a szövet fennmaradását az energiatermelés helyreállításával azonosítaná, teljesen félreértelmezné ezt a kísérletet.

Az agyi mitokondriumokon végzett munka a költségek oldalát is hozzáteszi ehhez a mérleghez. Ugyanazok az alacsony koncentrációk, amelyek javították a bioenergetikát, minden vizsgált körülmény között fokozták a hidrogén-peroxid képződését és lassították az eltávolítását. Ezt kalibrált Amplex-módszerrel mérték, nem egy nem specifikus festékkel. A több ATP és a több oxidáns együtt járt.

Gyakorlati ellenőrzőlista az értelmezéshez

Négy kérdés különíti el a kapcsolt eredményt a szétkapcsolttól.

Először is: melyik végpontot mérték ténylegesen? Az oxigénfogyasztás önmagában nem ad információt az ATP-ről. Az ATP-szintézis, a membránpotenciál és a légzési kontrollhányados egyaránt hozzátesz egy olyan részletet, amelyet az oxigénelektród nem lát. A metilénkékkel kapcsolatos kutatási állítások értelmezéséhez készült útmutató részletesen bemutatja a végpontok ilyen következetes megkülönböztetését.

Másodszor: melyik szubsztrát táplálta a mitokondriumokat? A szukcinil-CoA-val kapcsolatos eredmény megmutatja, hogy az energiaforrás megválasztása eldöntheti, válhat-e egyáltalán a fokozott légzésből több ATP.

Harmadszor: milyen koncentrációt alkalmaztak? A nanomoláris és alacsony mikromoláris tartományba eső metilénkék az agyi mitokondriumokban mérsékelt bioenergetikai javulást hozott, fokozott oxidánsterhelés árán; a máj mitokondriumaiban fél mikromoláristól felfelé romlott a kapcsolás; 5 mikromolárisnál ehhez duzzadás is társult. A koncentráció a mechanizmus része, nem háttéradat.

Negyedszer: milyen modellből származott az eredmény? Az izolált mitokondriumok feltárják a működés kapcsolatrendszerét, de az ép sejtekben és szövetekben ehhez hozzáadódik a transzport, a színtelen formává történő redukció és az elektronokért versengő felvevőhelyek hatása. A laboratóriumi adagolási vizsgálatok — köztük annak vizsgálata, hogyan alakítja a koncentráció és a protokoll a metilénkék hatásait — jelentik a hidat a kamrában mért értékek és az emberekre vonatkozó bármely állítás között.

Az oxigénfogyasztás az elektronáramlást jelzi. Az ATP azt mutatja, hogy ennek az áramlásnak mekkora része rögzült energiaként. A metilénkék bármelyiket megváltoztathatja, és a fenti kísérletek mind a négy következő kombinációt bemutatják: mindkettő nő; a légzés fokozódása csak ott jár ATP-növekedéssel, ahol ezt a szubsztrát lehetővé teszi; a légzés nő, miközben a kapcsolás romlik; a szövet megőrződik, miközben az ATP változatlan marad. Az oxigénelektródon leolvasott szám az értelmezés kezdete, nem a vége.