Metilénkék és Bartonella: laboratóriumi eredmények és a klinikai bizonyítékok korlátai

A tenyésztőedény és a beteg esetében ugyanazt a szót használjuk: fertőzés. A fogalom azonban nem ugyanaz. Az edényben a fertőzés az agaron megszámolható telepeket jelenti. A betegben sejtekben és erekben lévő baktériumokat, a vérben és szövetekben mozgó gyógyszereket, valamint a feladat egy részét végző immunrendszert. Ha összekeverjük a kettőt, egy feltűnő laboratóriumi számadat kezelésnek kezd látszani. Ha külön kezeljük őket, ugyanez a számadat az marad, ami valójában: indok a következő kísérlet elvégzésére.

A metilénkékről és a Bartonelláról szóló áttekintés teljes feladata ez a megkülönböztetés. Egy kutatócsoport két laboratóriumi vizsgálatban tesztelte a metilénkéket nem szaporodó állapotú Bartonella henselae ellen. Mindkettő erős aktivitásról számolt be üveg- és műanyag edényekben. Egyikben sem vizsgáltak embert.

Miért vizsgálják a kutatók a stacioner fázist?

A legtöbb antibiotikum-vizsgálat szaporodó sejteket használ. Ez a modell nem fedi le a nehezebb esetet: azokat a sejteket, amelyek már nem osztódnak, és elviselik a szaporodó társaikat elpusztító gyógyszereket.

A Bartonella fennmaradhat a szervezetben, többek között a vörösvértesteken és az endotélsejteken belül. A kutatócsoport ezért azt vizsgálta, hogy mely engedélyezett gyógyszerek képesek elpusztítani a B. henselae sejteket, miután azok stacioner fázisba kerültek. A szaporodó sejtekre vonatkozó alacsony MIC nem jelezte előre a stacioner fázisú sejtek elpusztítását. A rifampicin MIC-értéke nagyon alacsony volt, mégis gyengén pusztította a stacioner sejteket, míg a magasabb MIC-értékű vegyületek hatékonyan pusztították őket. Az ilyen tanulmányok értelmezéséhez általános módszert kereső olvasók a metilénkékkel kapcsolatos kutatások olvasásáról szóló útmutatóban találhatnak segítséget.

Első szűrővizsgálat: Li és munkatársai, 2019

Az Antibiotics folyóiratban megjelent 2019-es stacioner fázisú szűrővizsgálat egyetlen törzset, a B. henselae JK53-at használta, amelyet 10 százalék magzati szarvasmarhaszérumot tartalmazó Schneider-tápközegben, 37 C hőmérsékleten, 5 százalék CO2 mellett tenyésztettek. Az egynapos tenyészetek többnyire szétszórtan elhelyezkedő, osztódó sejtekből álltak. Az ötnapos, mL-enként körülbelül 10 a 8. hatványon telepképző egységet tartalmazó tenyészeteket stacioner fázisúnak tekintették; ezekben látható aggregátumok voltak.

A vizsgálat SYBR Green I-et és propídium-jodidot használt, élő és izopropanollal elpusztított sejtek keverékeihez kalibrálva. Mivel a metilénkék erősen színezett, a találatokat mikroszkóppal, majd a szigorúbb végpontot jelentő, véres agaron végzett telepszámlálással erősítették meg.

Az 50 mikromoláris koncentrációban vizsgált 1,581 engedélyezett gyógyszer közül a metilénkék a mikrolemez-olvasó szerint 16 százalékos, a mikroszkópos vizsgálat szerint 25 százalékos életképességet hagyott meg. A daptomicinnél ez 21 százalék volt, több azolnál 22–27 százalék, a gentamicinnél 32 százalék, az eritromicinnél 66 százalék, a ciprofloxacinnál 74 százalék. A pirvínium-pamoát a lemezolvasó alapján erősebbnek tűnt, saját fluoreszcenciája miatt azonban mikroszkóppal nem lehetett értékelni.

Szaporodó B. henselae esetén a metilénkék MIC-értéke 0.08–0.16 mikrogramm/mL volt. Az ötnapos stacioner sejtekben 5 mikrogramm/mL mellett egy nap expozíció után a telepszám a kimutathatósági határ alá csökkent, akárcsak a daptomicin és a pirvínium-pamoát esetében, azok vizsgált koncentrációin. Egy külön, időfüggő baktériumölő hatást vizsgáló kísérletben 10 mikrogramm/mL-t használtak. Ezek laboratóriumi expozíciós szintek, nem adagok, és a tanulmány is így közli őket. Egy hivatkozott, körülbelül 3.9 mikrogramm/mL-es humán plazmacsúcsérték csak háttérinformációként szerepel a tanulmányban. A metilénkék farmakokinetikájáról szóló áttekintés elmagyarázza, miért nem értelmezhető egy plazmaérték szöveti értékként.

A tanulmány két korlátot kifejezetten megnevez. Nem alkalmaztak biofilmmodellt, és nem tesztelték a metilénkéket kombinációkban. Az ötnapos aggregátumok stacioner folyadékkultúrában kialakult sejtcsoportok voltak, nem egy validált biofilmkísérlet részei. A szerzők állatkísérleteket, kombinációs vizsgálatokat, biofilmvizsgálatokat és más Bartonella-fajokon végzett teszteket sürgettek.

Kombinációk és biofilmből származó sejtek: Zheng és munkatársai, 2020

A BMC Microbiology folyóiratban megjelent 2020-as követő vizsgálat ugyanazt a törzset és tápközeget használta, de hatnapos stacioner tenyészetekre tért át, és két olyan elemmel bővült, amely az első tanulmányból hiányzott: két gyógyszer kombinációival és egy biofilmből származó sejteken alapuló modellel.

Az egyenként, egységesen 5 mikrogramm/mL koncentrációban, 24 órán át alkalmazott gyógyszerek közül a metilénkék után mL-enként 3.2-szer 10 a 4. hatványon telepképző egység maradt, míg a kontroll értéke közel 2.8-szer 10 a 10. hatványon volt. A ciprofloxacin, a gentamicin és a nitrofurantoin ugyanezen időpontban kevesebb telepet hagyott meg. Ez eltér a 2019-es eredménytől, amelynél ugyanazon névleges koncentráció mellett egy nap után nem maradt kimutatható telep. A tenyészetek kora, sűrűsége és kezelése eltért, így a baktériumölő hatás iránya reprodukálható volt, mértéke azonban nem volt azonos. A kísérletek közötti ilyen eltérés az egyik oka annak, hogy a szokásos biztonsági és kölcsönhatás-ellenőrzések a laboratóriumi hatáserősséget elkülönítik a klinikai hatástól.

A kombinációs szűrővizsgálatot idézik a leggyakrabban. Minden összetevő koncentrációját 5 mikrogramm/mL-ben rögzítették. Az azitromicin és metilénkék, valamint a rifampicin és metilénkék kombinációja után 24 óránál nem volt kimutatható stacioner fázisú telep; ugyanez volt igaz mindkét ciprofloxacin-tartalmú párosra is. A 25 vizsgált páros közül csak ez a négy adott ilyen eredményt. Formális szinergiaelemzést nem végeztek, ezért a helyes megnevezés az adott körülmények között aktív kombináció, nem pedig bizonyított szinergia.

A biofilmkísérlet egy fiatal, megbontott biofilmből kinyert sejteket vizsgált, nem az ép, érett biofilmbe való behatolást. A tenyészeteket öt napig növesztették, majd hígítás után mikrolemezek üregeiben további öt napig tenyésztették, kristályibolya-festéssel igazolták a biofilmet, végül a gyógyszeres expozíció előtt lekaparták. Az önmagában alkalmazott metilénkék 5 mikrogramm/mL mellett a 6. napra 2.3-szer 10 a 2. hatványon értékre csökkentette a telepszámot: az egyik legjobb önálló szer volt, de nem érte el a nullát. Mindkét metilénkék-kombináció a 6. napra nullát ért el, akárcsak mindkét ciprofloxacin-kombináció.

A szerzők ugyanazokat a korlátokat emelték ki, amelyeket egy figyelmes olvasó is észrevenne: fiatal, lekapart biofilm régi, ép biofilm helyett; minden gyógyszernél egyetlen, kényelmesen használható koncentráció az egyes gyógyszerek saját, reális csúcsértéke helyett; csak kiválasztott, azitromicinre vagy rifampicinre épülő párosok; egyetlen törzs; állatok és betegek nélkül. Későbbi, három gyógyszerrel végzett vizsgálatokat javasoltak, de ilyen eredményekről nem számoltak be.

A vizsgálati tervek összehasonlítása

A táblázat tömören összefoglalja e cikk lényegét. Az utolsó oszloptól balra minden tenyészeteken végzett munka. Egyik tanulmányból sem kerül semmi az utolsó oszlopba.

A Bartonella nem Borrelia

Mindkét tanulmány megemlíti a Borrelia burgdorferit, a Lyme-kórt okozó spirochétát, mert a festékes vizsgálati módszer ugyanannak a laboratóriumnak a korábbi, stacioner fázisú Borreliával végzett munkájából származott, amelyben a metilénkék és a daptomicin szintén találatnak bizonyult. Ez az előzmény hasznos háttérinformáció, ugyanakkor gyakori hibaforrás.

A két Bartonella-tanulmány egyik kísérlete sem vizsgálja egymás mellett a Borreliát és a Bartonellát. A mikroorganizmusok, a tápközegek és a koncentrációk eltérnek, a metilénkék Bartonellára gyakorolt feltételezett membránhatását pedig további vizsgálatot igénylő feltevésként közölték. Az eredményeket nem szabad egyik fajról a másikra átvinni, és egyik tanulmány sem támaszt alá általános állításokat a parazitákról. A Borrelia és a Bartonella perzisztáló sejtjeinek összehasonlítása ezért kezeli külön a két szakirodalmat.

Miért nem lesz a tenyésztési eredményekből protokoll?

Érthető, hogy sokan keresnek metilénkék–Bartonella-protokollt. Éppen ezek a tanulmányok indokolják, hogy ezt a kifejezést inkább figyelmeztető jelként, ne bevásárlólistaként kezeljük.

Először is, az 5 mikrogramm/mL egy mikrolemez üregében nem orvosi előírás. Nem tartozik hozzá felszívódás, eloszlás, fehérjekötődés, sejten belüli penetráció vagy tolerálhatóság. A szerzők az antibiotikumok csúcskoncentrációinak durva átlagaként választották ezt az értéket, és jelezték, hogy a későbbi munkákban minden gyógyszert a saját, reális koncentrációján kell vizsgálni.

Másodszor, a nulla telep azt jelenti, hogy az adott kioltási körülmények között nem jelentek meg telepek, nem pedig azt, hogy a szövet steril. A perzisztáló sejtek, a sejten belüli baktériumok és a mintavétel korlátai mind kívül esnek az agarlemez keretein.

Harmadszor, azok a kombinációk, amelyek sterilizálnak egy mikrolemez-üreget, a szervezetben hatástalanok vagy károsak lehetnek. Az azitromicin és metilénkék, valamint a rifampicin és metilénkék laboratóriumi párosok, laboratóriumi expozíció mellett. Állatokon végzett farmakokinetikai vizsgálatok és kontrollált humán adatok nélkül nincs meghatározott adag, kezelési időtartam vagy előny–kockázat arány. Aki a lehetőségeket mérlegeli, beszélje meg őket kezelőorvosával, és tekintse át, mikor igényel orvosi felügyeletet a metilénkék használata, mielőtt bármilyen következtetést vonna le a tenyésztőedényekből származó adatokból.

A tanulmányok által alátámasztott szűk következtetés a következő: a metilénkék reprodukálható aktivitást mutat a nem szaporodó B. henselae JK53 ellen in vitro, két gyógyszer laboratóriumi kombinációiban is; a legerősebb kombinációs és biofilmből származó sejteken kapott eredmények a 2020-as vizsgálatból származnak. Minden más, köztük az is, hogy ez az aktivitás számít-e az emberi bartonellózisban, továbbra is vizsgálatlan.