EMB agar kontra MacConkey agar: táptalajválasztás és értelmezés

Egy hallgató ugyanazt a vízmintát két lemezre széleszti ki. Az egyiken sötét, zöldes fémes fényű telepek jelennek meg. A másikon élénk rózsaszín telepek láthatók ködös udvarral. Mindkét lemezt ugyanabból a csőből oltották be, egymás mellett inkubálták, és ugyanabban az időpontban olvasták le. A hallgató azt kérdezi, melyik lemez eredménye helyes.

Mindkettő helyes. Más kérdésre adnak választ. A zavar abból ered, hogy a két táptalajt felcserélhető szűrővizsgálatként kezelik a bélbaktériumok kimutatására. Közös céljuk a Gram-negatív enterális mikroorganizmusok szelektálása és a laktózfermentálók elkülönítése a nem fermentálóktól, de ezt eltérő kémiával és eltérő vizuális logikával valósítják meg. Ha megérti a két alapelvet, a táptalaj kiválasztása és a telepek leolvasása rutinfeladattá válik.

Röviden

Az EMB agar két festéket, eozin Y-t és metilénkéket használ, amelyek egyszerre két feladatot látnak el: gátolják a Gram-pozitív baktériumok növekedését, és az erős savtermelők körül kicsapódva sötét telepeket hoznak létre, Escherichia coli esetén klasszikusan fémesen zöld csillogással. A MacConkey agar szétválasztja ezeket a feladatokat: az epesók és a kristályibolya gátolják a Gram-pozitívokat, a laktóz biztosítja a fermentáció szubsztrátját, a neutrálvörös pedig rózsaszín vagy vörös telepek formájában jelzi a savtermelést. Ha a feladat az E. coli látványos, előzetes kimutatása, az EMB indokolt választás. Ha a cél a laktózfermentálók és a nem fermentálók egyértelmű, rózsaszín és színtelen csoportokra osztása, különösen széklet- vagy vizeletminták feldolgozásakor, a MacConkey rendszerint egyszerűbben leolvasható. Önmagában a telep színe egyik lemezen sem azonosítja a mikroorganizmust.

EMB: egyszerre szelektáló és jelző festékek

Az EMB alapelve a szelekciót és az indikációt ugyanazokba a molekulákba sűríti. Az ASM eozin-metilénkék agar protokollja az EMB-t szelektív és differenciáló táptalajként írja le: a festékpár számos Gram-pozitív mikroorganizmust gátol, miközben a laktózfermentáció elősegíti a festék felvételét és kicsapódását. A standard Levine-összetétel peptont, laktózt, foszfátot, eozin Y-t, metilénkéket és agart tartalmaz, ahogy azt az FDA BAM Levine EMB agar módszere felsorolja. Fontos, hogy egyes régebbi EMB-receptek a laktóz mellett szacharózt is tartalmaztak, míg a Levine EMB laktózt tartalmaz szacharóz nélkül, ezért dokumentálja, hogy laboratóriuma melyik formulációt használja.

Az EMB leolvasása a festék viselkedésének értelmezését jelenti. Az intenzív laktózfermentáció elegendő savat termel ahhoz, hogy erőteljes festékkicsapódást idézzen elő, ami az E. coli telepeinek sötét kékesfekete közepét, klasszikus esetben pedig visszavert fényben fémesen zöld csillogását eredményezi. A gyengébben fermentáló baktériumok, például az Enterobacter és a Klebsiella, jellemzően rózsaszín–lila, nyálkás telepeket képeznek ilyen csillogás nélkül. A nem fermentálók, például a Salmonella, a Shigella és a Proteus, általában színtelen vagy áttetsző telepek formájában növekednek, mivel nem idéznek elő olyan hirtelen savtermelést, amely kicsapná a festékeket. A Gram-pozitívok növekedése rendszerint gátolt, bár a gátlás mértéke törzsenként és termékenként változik. A festékek előkészítésének részletes kémiája, beleértve azt is, hogy a metilénkék miért viselkedik eleve kationos festékként, külön tárgyalandó a festékformulációk kapcsán, az általános mikroszkópos összefüggések pedig egy festési módszereket bemutató atlaszban találhatók. Ez a cikk a táptalaj kiválasztására és leolvasására összpontosít.

A fenti ábra szemléltető jellegű. A várható vizuális logikát mutatja: az EMB-n sötét, csillogó telepek, rózsaszín nyálkás típusok és halvány típusok láthatók, míg a MacConkey-lemezen rózsaszín és halvány típusok különülnek el. Használja a mintázat megtanulására, majd minden értékelést ellenőrizzen fényképezett kontrollok és az adott munkaállomáson használt táptalaj termékismertetője alapján.

MacConkey: különálló feladatok, egyszerűbb vizuális szabály

A MacConkey alapelve minden feladatot külön összetevőhöz rendel. Az ASM MacConkey agar protokollja ugyanezt a szelektív és differenciáló megközelítést ismerteti, az FDA BAM MacConkey agar módszere pedig felsorolja a működéshez szükséges összetevőket: peptonokat, laktózt, epesókat, sót, neutrálvöröst, kristályibolyát és agart. Az epesók és a kristályibolya együttesen szelektálnak a Gram-pozitívok ellen. A laktóz biztosítja a fermentáció szubsztrátját. A neutrálvörös pH-indikátorként működik: savképződés helyén rózsaszínről vörösre változik, erős fermentálók körül pedig esetenként epesók is kicsapódnak.

A leolvasási szabály szándékosan egyszerű: a rózsaszín laktózfermentálót, a színtelen vagy halvány telep nem fermentálót jelent. Az E. coli rózsaszín–vörös színű, gyakran epesó-kicsapódási udvarral. A Klebsiella és az Enterobacter rózsaszín, és tokjuk miatt gyakran nyálkás megjelenésű. A Salmonella, a Shigella, a Proteus és számos más Gram-negatív pálca színtelennek látszik. Az oktatólaboratóriumok számára további előnyt jelent, hogy az epesók általában csökkentik a Proteus rajzását, ezért MacConkey agaron könnyebb izolált telepeket nyerni, mint nem szelektív táptalajokon, bár a gátlás nem teljes, és léteznek sómentes alternatívák is olyan esetekre, amikor a rajzás visszaszorítása az elsődleges cél.

A festékek ilyen viselkedésének molekuláris oka a töltésükre és szerkezetükre vezethető vissza. A metilénkék kationos fenotiazin festék, amelynek szerkezete és tulajdonságai magyarázzák a savas baktériumfelszínek iránti affinitását; ugyanez az affinitás érvényesül akkor is, amikor az EMB savas zónáiban kicsapódik.

Összehasonlítás egy pillantásra

A táblázatot döntési eljárásként használja. Ha a gyakorlat célja, hogy a hallgatók lássák a fermentáció erősségének fokozatait egy látványos végponttal, az EMB ezt mutatja meg. Ha a gyakorlat célja egy gyors, két kategóriás elkülönítés a biokémiai megerősítés előtt, a MacConkey alkalmas erre.

Melyik táptalaj melyik mintához

Az olyan vízvizsgálati gyakorlatokhoz, amelyek célja a feltételezett fekális coliformok vagy az E. coli felismerése, az EMB vonzó választás, mert a csillogás vizuálisan jellegzetes. A MacConkey szintén alkalmas enterális Gram-negatívok vizsgálatára, és történelmileg vízvizsgálatokban is alkalmazták, de egyik lemez sem helyettesít szabályozásban előírt vízvizsgálati módszert, amely a vizsgálattól függően például módosított mTEC vagy MI táptalajt írhat elő. Ellenőrizze a laboratóriumára kötelezően alkalmazandó módszert.

A fermentálók és nem fermentálók székletmintákhoz hasonló elkülönítésére a kettő közül általában a MacConkey a hasznosabb. A Salmonella vagy Shigella gyakorlati, székletmintából történő vizsgálata rendszerint további, szelektívebb enterális táptalajokat, például XLD-t vagy Hektoen enteric agart is alkalmaz, ahelyett hogy kizárólag MacConkey agarban bízna.

A klinikai munkafolyamatot utánzó, vizeletmintás oktatáshoz a MacConkey agart véragarral párosítsa. A MacConkey biztosítja a Gram-negatívok korai elkülönítését, míg a véragar olyan mikroorganizmusokat is visszanyer, amelyeket a MacConkey gátol. Ezt a párosítást a vizelettenyésztés klinikai leírásai szabványos elrendezésként ismertetik.

Az alapelvek tiszta oktatásához használja mindkettőt. Az EMB azt tanítja meg, hogy a fermentáció erőssége számít, és hogy egyetlen molekula két szerepet is betölthet. A MacConkey a moduláris felépítést szemlélteti: a szelektor, a szubsztrát és az indikátor külön van választva. Azok a hallgatók, akik egy ismert E. coli, egy ismert Klebsiella aerogenes és egy ismert Salmonella törzset egymás mellett szélesztenek ki mindkét táptalajra, később ritkán keverik össze a két rendszer logikáját.

Minden félévben visszatérő leolvasási hibák

A leggyakoribb hiba a kizárólag szín alapján történő azonosítás. A MacConkey agaron megjelenő rózsaszín telep lehet E. coli, Klebsiella, Enterobacter vagy más fermentáló baktérium. A színtelen telep lehet Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas vagy más nem fermentáló baktérium. A szín olyan szűrővizsgálati fenotípus, amely a megerősítő vizsgálatok, például a Gram-festés, az oxidázteszt, a biokémiai panelek vagy a műszeres azonosítás irányát jelöli ki, nem pedig fajnevet ad.

A második hiba a csillogás hiányának túlértékelése. Egyes valódi E. coli-telepek, különösen az izolált telepek, alig vagy egyáltalán nem mutatnak fémes csillogást EMB-n. A csillogás hiánya nem zárja ki az E. coli jelenlétét, és a csillogás megléte sem bizonyítja azt. A csillogást előzetes támpontként kezelje.

A harmadik hiba a különböző korú lemezek összehasonlítása. A késleltetetten laktózt fermentáló baktériumok hosszabb inkubáció után rózsaszínné válhatnak MacConkey agaron, ami elmossa a fermentálók és nem fermentálók közötti egyértelmű különbséget. A leolvasást a laboratórium által meghatározott időpontban végezze, és az inkubáció idejét az eredménnyel együtt dokumentálja.

A negyedik hiba a kevert növekedés egyetlen mikroorganizmusként történő értelmezése. Egy rózsaszín telep egy színtelen telep mellett két fenotípust jelent, nem egy köztes állapotot. Jól izolált telepeket válasszon, és minden morfotípust külön dolgozzon fel. A nyálkás állag hasonló csapdát jelent: a Klebsiella és az Enterobacter egyaránt lehet nyálkás megjelenésű, ezért a tok önmagában soha nem dönti el az azonosítást. A korábban Enterobacter aerogenes néven oktatott mikroorganizmust ma Klebsiella aerogenes néven osztályozzák, ami megmagyarázza, miért tűnnek ellentmondásosnak a régebbi táblázatok és az újabb megnevezések.

Kontrollok és záró szabály

Minden alkalommal használjon fényképezett vagy friss kontrollokat: E. coli-t az erős fermentációs reakcióhoz, Klebsiella aerogenes-t a klasszikus csillogás nélküli nyálkás fermentációhoz, egy Salmonella törzset a színtelen, nem fermentáló reakcióhoz, valamint Staphylococcus aureus-t annak ellenőrzésére, hogy az adott termék valóban gátolja-e a Gram-pozitív növekedést. A törzsszámokat és elfogadási kritériumokat igazítsa a gyártó termékismertetőjéhez, mert a szelektivitás az epe-, kristályibolya- és festéktartalom függvényében változik.

A munkaasztalnál egyetlen mondatot érdemes megjegyezni. Az EMB olyan festékeket használ, amelyek egyszerre szelektálnak és jeleznek, így látványos E. coli-jelet adnak, cserébe finomabb értelmezést igényelnek. A MacConkey különválasztja a szelekciót és a jelzést, így egyszerű rózsaszín–halvány elkülönítést ad, cserébe kevesebb információt mutat a fermentáció erősségéről. A vizsgálati kérdéshez illeszkedő táptalajt válassza, a színt megfelelő vizsgálatokkal erősítse meg, és a két lemez többé nem egymással verseng, hanem egymást kiegészítve működik.