Atik
Nouvo ble metilèn ak kolorasyon retikilosit: yon koloran apa ak yon metòd sou selil vivan
Yon etidyan ap prepare yon kontaj retikilosit, li kòmande ble metilèn, li melanje l ak san, epi li pa wè prèske anyen. Yon kamarad klas sèvi ak yon boutèy ki make nouvo ble metilèn epi li jwenn filaman ble byen klè andedan yon pati nan selil wouj yo. Premye etidyan an sipoze dezyèm boutèy la pi fre oswa pi konsantre. Se pa youn ni lòt. Li gen yon molekil diferan ladan l.
Se erè konseptyèl sa a ki dèyè pifò konfizyon nan domèn sa a. Non an fè kwè nouvo ble metilèn se yon lo ble metilèn yo amelyore. Chimi a montre se pa sa. Nouvo ble metilèn N se yon koloran fenotyazin apa ki gen pwòp nimewo Colour Index li, pwòp modèl sibstitisyon li, ak pwòp wòl estandadize li nan ematoloji. Yon fwa diferans sa a klè, rès metòd la vin fasil pou konprann: poukisa selil yo dwe vivan lè yo kolore yo, ki sa ki konte kòm yon retikilosit, ki plas kò Heinz yo genyen, ak ki lè ble kresil briyan antre nan diskisyon an.
Repons kout la
Nouvo ble metilèn N, reyaktif ematoloji a, jeneralman idantifye kòm Basic Blue 24 nan fich PubChem pou nouvo ble metilèn, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, fòmil C18H22ClN3S. Ble metilèn òdinè se klori metiltyoninyòm, Basic Blue 9, nan fich PubChem li, C.I. 52015, CAS 61-73-4, fòmil C16H18ClN3S. Sou plan estriktirèl, nouvo ble metilèn gen de gwoup metil sou bag la ak chèn lateral etilamino kote ble metilèn gen gwoup dimetilamino. Diferans sa a chanje konpòtman kolorasyon an. Liv ematoloji yo dekri ble metilèn òdinè kòm yon koloran relativman fèb pou retikilosit, epi nouvo ble metilèn kòm yon koloran ki bay yon koulè pi fon e pi inifòm; sijè ScienceDirect sou nouvo ble metilèn rezime konparezon sa a.
Wi, nouvo ble metilèn se yon koloran sipravital. Kolorasyon sipravital vle di kolore selil vivan apre yo fin retire yo nan kò a epi anvan fiksasyon, jan revizyon NCBI sou prensip kolorasyon sipravital defini l. Ni nouvo ble metilèn ni ble kresil briyan antre nan kategori sa a, epi estanda CLSI pou retikilosit la trete nouvo ble metilèn klèman kòm yon koloran sipravital. Pafwa etidyan yo mete sa nan menm kategori ak kolorasyon Romanowsky sou fwoti fikse. Fason sa a pou konprann bagay yo pa mache isit la. Si ou fè fiksasyon an an premye, metòd la sispann mache.
Pou lektè k ap suiv non koloran ki sanble yo, ble metil kont ble metilèn trete yon lòt konfizyon ki pi laj ant yon koloran triyarilmetàn anyonik ak fanmi fenotyazin katyonik la. Apèsi sou kolorasyon nan laboratwa mete travay sipravital la nan kontèks metòd sou fwoti fikse yo, epi gid mòfoloji selil san an montre ki plas evalyasyon retikilosit genyen nan kontaj diferansyèl ki pi laj la.
| Reyaktif | Idantite | C.I. / CAS | Wòl nan travay sou retikilosit |
|---|---|---|---|
| Nouvo ble metilèn N | Fenotyazin etilamino ki gen de gwoup metil sou bag la | C.I. 52030 (Basic Blue 24); CAS 1934-16-3 pou klori a | Koloran sipravital manyèl estandadize, referans konparezon yo prefere |
| Ble metilèn òdinè | Fenotyazin bis(dimetilamino) (klori metiltyoninyòm) | C.I. 52015 (Basic Blue 9); CAS 61-73-4 | Koloran fèb pou retikilosit, li pa yon ranplasan |
| Ble kresil briyan | Koloran oksazin, fòmilasyon an varye selon founisè a | C.I. 51010; CAS 81029-05-2 oswa 10127-36-3 selon fòm sèl la | Koloran sipravital akseptab, mwens inifòm, li pa referans konparezon amonize a |
Yon prekosyon pou katalòg yo: genyen yon lòt fòm nouvo ble metilèn ki se yon sèl doub ak klori zenk, anba CAS 6586-05-6. Se poutèt sa yon seksyon metòd dwe bay non fòm sèl la ak founisè a, pa sèlman non komen an.
Sa kolorasyon sipravital fè toutbon
Yon retikilosit se yon jèn selil wouj ki pèdi nwayo li men ki toujou gen rès ARN ribozomal. Nan yon preparasyon imid ki pa kolore, ARN sa a envizib. Koloran sipravital la antre nan selil vivan an epi li fè ARN sa a presipite oswa rasanble an granil ak filaman ble: materyèl retikilofilamantè yo wè anba imèsyon nan lwil la. Rezo a se donk yon pwodui kolorasyon an, li pa yon eskèlèt ki te deja fòme e ki t ap tann koulè. Se poutèt sa varyab pwotokòl yo (konsantrasyon koloran an, tanpon an, rapò san ak koloran, tanperati, tan) enpòtan menm jan ak non koloran an.
Konsekans pratik la se yon lòd operasyon strik: melanje san ki gen antikowagilan ak koloran an an premye, enkibe l, epi fè fwoti yo pou egzamine yo san fiksasyon e san kontrekolorasyon. Fiksasyon anvan kolorasyon, oswa yon kontrekolorasyon ki kache filaman ki pal yo, detwi enfòmasyon kontaj la depann sou li a.
Yon pwotokòl pratik pou retikilosit ak nouvo ble metilèn
Pa gen yon sèl fòmilasyon inivèsèl, kidonk rapòte sa ou itilize a. Twa varyant ki dokimante montre seri posiblite yo.
Pwosedi klasik tip Brecher la sèvi ak anviwon 0.5 pousan nouvo ble metilèn ak oksalat potasyòm, yo melanje an volim egal ak san EDTA byen melanje, epi yo enkibe pandan anviwon 10 a 15 minit nan tanperati chanm. Apre yo fin remelanje l dousman, yo prepare fwoti mens an fòm kwen, yo kite yo seche nan lè, epi yo egzamine yo san fiksasyon anba objektif 100x pou imèsyon nan lwil. Pwosedi NCBI pou kontaj retikilosit dekri etap travay sa yo ak kad kontaj yo sèvi avè l la.
Varyant Dacie ak Lewis la sèvi ak 1.0 pousan nouvo ble metilèn nan solisyon salin ak sitrat, yo melanje l ak 2 a 4 volim san epi yo kenbe l nan 37 C pandan 15 a 20 minit anvan yo fè fwoti yo. Yon aplikasyon amonizasyon resan pou pwosedi CLSI H44 la te sèvi ak yon solisyon pi fèb, 0.1 pousan, nan solisyon salin tanponnen ak fosfat nan pH 7.4, avèk enkibasyon nan 20 C pandan 10 minit epi san fiksasyon, jan etid amonizasyon NMB 2026 la rapòte l.
Règ kontaj yo menm nan tout varyant yo. Konte yon selil kòm retikilosit lè li gen omwen de granil byen separe oswa de segman filaman ki pran koulè ble; sa elimine depo koloran izole yo. Konte omwen 1,000 selil wouj nan travay woutin epi rapòte retikilosit yo kòm yon pousantaj. Lè pousantaj yo ba, estatistik yo mande plis selil. Yon revizyon metodoloji CLSI H44 la fè remake ke lè retikilosit yo prèske 1 pousan, ou bezwen anviwon 4,400 selil pou redui varyasyon kontaj la a 5 pousan, nan revizyon CLSI H44 sou De Gruyter. Yon disk okilè Miller rann gwo kontaj yo pratik. Filtre koloran an oswa prepare l fre, paske presipite yo sanble ak enklizyon granilè.
Kò Heinz nan menm preparasyon an
Menm fwoti sipravital la ka montre kò Heinz tou; sa yo se aglomera emoglobin okside ak denatire olye de rès ARN. Nan preparasyon ak nouvo ble metilèn, yo parèt tankou kò won, souvan yon sèl epi toupre manbràn nan, ki pran yon ble pi pal pase materyèl retikilofilamantè a. Yo pa konsève byen pandan fiksasyon ak kontrekolorasyon, kidonk egzamine fwoti a san fiksasyon. Yon pwotokòl resan ki sèvi ak 20 mikwolit san EDTA ansanm ak 20 mikwolit nouvo ble metilèn a 1 pousan ak 15 minit enkibasyon te mezire kantite selil ki gen kò Heinz pami 250 eritwosit, nan etid PMC ki rapòte pwosedi sa a.
De distenksyon ede evite move entèpretasyon. Premyèman, vyolèt metil ak vyolèt kristal kolore kò Heinz pi fò pase nouvo ble metilèn, jan sijè ScienceDirect sou kò Heinz fè remake l. Nouvo ble metilèn se chwa pratik la lè yo evalye retikilosit ak kò Heinz ansanm, li pa koloran espesifik pou kò Heinz ki pi fò a. Dezyèmman, enklizyon HbH nan karakteristik talasemi alfa pwodui anpil ti pwen fen atravè selil la apre kolorasyon sipravital, tandiske kò Heinz klasik yo mwens anpil, pi gwo, epi souvan asosye ak manbràn nan. Depo koloran se twazyèm bagay ki ka sanble ak yo: li deyò plan fokal selil yo epi li varye ant chan mikwoskopik yo.
Ble kresil briyan kont nouvo ble metilèn
Toude koloran yo se koloran sipravital pou retikilosit, men estandadizasyon favorize youn ladan yo. Metòd retikilosit CLSI H44-A2 a, ki devlope ansanm ak Konsèy Entènasyonal pou Estandadizasyon nan Ematoloji epi ki parèt sou paj estanda CLSI H44 la, deziyen kolorasyon san EDTA ak nouvo ble metilèn kòm metòd konparezon manyèl la. Ansèyman klasik ematoloji dakò sou aparans lan: nouvo ble metilèn bay filaman yo yon kolorasyon pi fon e pi inifòm, tandiske ble kresil briyan varye plis ant lo ak echantiyon yo.
Estati sa a bezwen yon presizyon. Gid ICSH pou evalyasyon analizè aksepte mikwoskopi manyèl ak nouvo ble metilèn kòm yon apwòch konparezon referans, men li rele l sibjektif ak relativman enpresi, epi li prefere pwosedi referans sitometri an koule lè yo disponib. Yon konparezon 2022 sou 100 echantiyon te jwenn yon patipri pi ba parapò ak analizè li a lè li te sèvi ak ble kresil briyan olye de nouvo ble metilèn, jan konparezon metòd kolorasyon sou PMC rapòte l. Rezime etidyan yo ka defann lan se sa a: sèvi ak nouvo ble metilèn kòm referans konparezon manyèl estandadize a, verifye nenpòt metòd lokal ak ble kresil briyan kont li oswa kont yon metòd otomatik, epi atann plis dispèsyon nan rezilta mikwoskopi manyèl yo nan toude ka yo. Ansyen piblikasyon sou estandadizasyon yo te rekòmande Azure B pirifye tou kòm yon altènativ ki pi pwòp sou plan chimik, paske lo koloran komèsyal yo te varye, nan etid Marshall sou Azure B; sa esplike poukisa klas kalite reyaktif la toujou parèt nan diskisyon sou metòd yo.
Evite erè abityèl yo
Kat erè esplike pifò preparasyon ki pa reyisi yo. Kòmande ble metilèn òdinè olye de nouvo ble metilèn N bay yon kolorasyon fèb akoz chimi a, pa akoz teknik la. Fè fiksasyon oswa kontrekolorasyon anvan lekti retire siyal sipravital la. Konte presipite koloran kòm granil gonfle rezilta a; règ de granil la ak koloran filtre anpeche sa. Konte twò kèk selil lè pousantaj retikilosit yo ba bay yon chif ki sanble presi men ki gen limit konfyans laj. Chak erè gen menm siyati a: moun k ap fè mikwoskopi a blame mikwoskòp la pou sa etap reyaktif la te deja detèmine.