Atik
Ble metilèn ak otofaji: AMPK, mTOR, ak eksperyans sou newòn
Imajine w ap fè yon eksperyans sou selil, ou ajoute ble metilèn, epi ou wè yon bann pwoteyin ki rele LC3-II vin pi fonse sou manbràn analiz ou a. Li fasil pou w anvi anonse konpoze a "ogmante otofaji" epi pase nan lòt bagay. Entèpretasyon sa a twò bonè. Yon bann LC3-II ki pi fonse ka vle di selil la ap pwodui plis vezikil pou netwayaj, oswa li ka vle di vezikil yo ap akimile paske etap eliminasyon an bloke. De entèpretasyon sa yo ale nan direksyon opoze, epi piblikasyon syantifik sou ble metilèn nan newòn yo gen egzanp prèv pou chak nan yo. Atik sa a esplike sa yo te mezire toutbon, tès pa tès.
Makwootofaji, fòm yo etidye la a, se pwosesis selil la itilize pou resikle materyèl an gwo. Yon sak manbràn ki rele fagofò grandi toutotou pwoteyin ak òganit ki fin itilize, li fèmen pou l fòme yon otofagozòm, li fizyone ak yon lizozòm, epi sa li pote a degrade epi libere pou reutilizasyon. Newòn yo depann de pwosesis regilye sa a paske yo pa divize epi yo pa ka diminye konsantrasyon pati ki domaje yo lè yo separe an de. Lè resiklaj la bloke, dechè akimile. Lè li mache, selil la rekipere eleman debaz pou konstriksyon pandan li anba estrès.
Sa yon eksperyans sou selil ipokanp te montre
Etid prensipal sou endiksyon an te itilize selil HT22 ki soti nan ipokanp sourit, yo te mete anba estrès lè yo te prive yo de sewòm pandan 24 èdtan. Kondisyon sa a retire faktè kwasans ak siyal twofik epi li deklanche ni apoptoz ni otofaji. Chèchè yo te rapòte ble metilèn te diminye lanmò selil yo selon dòz la, epi pwoteksyon sa a te mache ansanm ak siy makwootofaji.
Chanjman makè yo te presi. Kolorasyon LC3B ki te gaye nan selil la te redistribiye pou fòme ti pwen toutotou nwayo a, apati anviwon 20 nM ble metilèn, ak pi gwo repons LC3-I ak LC3-II toupre 1 μM. Ni LC3B-I ni LC3B-II te ogmante selon dòz la ak dire ekspozisyon an. Sa ki enpòtan anpil, ekip la te ale pi lwen pase yon analiz estatik LC3 sou manbràn. Yo te ajoute 10 μM klowokin, ki bloke eliminasyon materyèl nan lizozòm yo, epi yo te jwenn plis LC3-II ansanm ak p62 ki te estabilize nan selil yo te trete ak ble metilèn. Modèl sa a soutni yon pwosesis renouvèlman ki depann de lizozòm, olye de yon senp akimilasyon. Yo te montre tou klowokin te anile yon pati nan efè anti-apoptotik la, sa ki lye pwoteksyon an ak chemen otofaji ak lizozòm nan modèl sa a.
Rezilta sou siyalizasyon an se pati yo pi souvan site mal. Siyalizasyon AMPK, yo te evalye atravè AMPK fosforile ak ACC fosforile, sib li ki pi lwen nan chemen an, te ogmante nan 12 ak 24 èdtan selon dòz la. Inibitè AMPK ki rele Compound C, yo te aplike nan 20 μM pandan 4 dènye èdtan yo, te diminye ni fosforilasyon ACC ni aktivasyon LC3. Okontrè, mTOR fosforile pa t montre okenn sipresyon yo te kapab detekte. Kidonk, nan selil ipokanp ki anba estrès yo, rezilta a se te yon endiksyon ki lye ak AMPK atravè yon chemen ki te sanble endepandan de mTOR. Menm modèl la te parèt nan sourit vivan, kote tretman ak ble metilèn te pwovoke makè makwootofaji nan kòtèks la ak ipokanp la.
Endiksyon pa vle di fliks la rive jouk nan bout
Se la diferans ant konsèp yo pi enpòtan. Endiksyon vle di mekanis ki nan kòmansman chemen an pwodui plis otofagozòm. Fliks vle di materyèl la suiv tout chemen an: anprizònman, matirasyon, fizyon ak lizozòm, degradasyon, resiklaj. Chak ogmantasyon LC3-II rete yon deklarasyon sou endiksyon jiskaske yon tès fliks konfime rès trajè a.
Tès fliks estanda a mezire LC3-II avèk ak san yon blokaj lizozòm kout, tankou sa bafilomycin A1 oswa klowokin pwodui. Si tretman an vrèman akselere pwodiksyon an, bloke destriksyon an ta dwe fè LC3-II monte pi wo toujou. Yon rapòtè an tandem mCherry-GFP-LC3 bay yon dezyèm fason pou evalye sa: estrikti yo klere jòn anvan fizyon ak lizozòm nan, epi yo klere sèlman wouj apre asid la etenn siyal GFP a. Konsa, plis ti pwen ki sèlman wouj soutni lide pwosesis la ap avanse pou rive nan otolizozòm asid yo. Yon nivo pwoteyin p62 ki bese ka konfime renouvèlman materyèl la, men fòk yo sonje transkripsyon p62 li menm reyaji ak estrès epi yo ta dwe verifye li nan nivo mRNA.
Lis verifikasyon ki anba a montre pou chak tès yo itilize nan piblikasyon sa yo sa li mezire ak sa li pa ka pwouve poukont li. Lektè yo ka sèvi avè l ankò pou nenpòt deklarasyon sou makwootofaji nan lavni, tankou agiman sou jèn ak lonjevite ki sèvi ak makè sa yo.
| Tès | Sa li mezire | Sa li pa ka pwouve poukont li |
|---|---|---|
| Nivo LC3B-I | Kantite prekisè ki disponib nan sitozòl la pou lipidasyon | Aktivite otofaji; sentèz ak pwosesis transfòmasyon yo chanje li tou |
| Nivo LC3B-II | Kantite LC3 ki mare ak manbràn sou estrikti otofajik yo | Fliks ki rive jouk nan bout; yon ogmantasyon ka vle di pwodiksyon pi rapid oswa eliminasyon ki bloke |
| Ti pwen LC3 ak agregasyon toutotou nwayo a | Redistribisyon LC3 nan estrikti vezikilè | Direksyon chanjman an; imaj estatik pa ka fè diferans ant akselerasyon ak yon blokaj nan sikilasyon |
| LC3-II avèk konpare ak san klowokin oswa bafilomycin A1 | Si nouvo otofagozòm kontinye fòme lè eliminasyon an bloke | Degradasyon konplè materyèl la; li nesesè pou ekspozisyon ak inibitè a kout epi byen ajiste |
| Nivo pwoteyin p62 | Renouvèlman yon adaptè materyèl yo nòmalman detwi nan otolizozòm | Fliks poukont li; chemen repons a estrès yo kontwole transkripsyon p62 tou |
| Rapòtè an tandem mCherry-GFP-LC3 | Pwogresyon pou rive nan otolizozòm asid yo (chanjman soti nan jòn pou rive nan wouj sèlman) | Degradasyon konplè tout kalite materyèl |
| Phospho-AMPK ak phospho-ACC | Aktivasyon detektè estrès enèjetik la ak repons li pwodui | Otofaji te lakòz efè sou siviv la; AMPK kontwole anpil branch metabolik |
| Phospho-mTOR, p70S6K, 4EBP1 | Aktivite chemen siyalizasyon kwasans ki limite otofaji a | Fliks; sa yo se siyal otorizasyon nan kòmansman chemen an, se pa mezi eliminasyon |
Remake yon pyèj nan fason yo sèvi ak mo yo tablo a ede evite. ACC fosforile se fòm kote aktivite anzimatik la inibe. Ogmantasyon li montre repons AMPK pwodui a, se pa aktivasyon ACC.
Fraz "inibisyon makwootofaji te elimine newopwoteksyon an" mande menm presizyon an. Nan modèl HT22 a, li vle di deranje chemen otofaji ak lizozòm nan te retire avantaj ble metilèn te bay pou siviv pandan privasyon sewòm nan. Sa soutni lide otofaji te nesesè oswa te kontribye nan kondisyon kilti sa yo. Li pa etabli otofaji kòm sèl mekanis pwoteksyon konpoze a, li pa pwouve klowokin aji sèlman atravè otofaji, epi yo ta bezwen entèvansyon jenetik sou ATG5, ATG7, oswa ULK1 pou ranfòse deklarasyon sou kòz la.
De chemen ki antre nan menm mekanis la
Yon kat senplifye ede konprann. Estrès enèjetik ogmante AMPK, AMPK aktive konplèks ULK1 la, epi otofaji kòmanse. Faktè kwasans ak eleman nitritif ogmante mTORC1, mTORC1 inibe ULK1, epi otofaji rete inaktif. Pi lwen pase ULK1 nan chemen an, konplèks Beclin-1 ak VPS34 la kòmanse fòmasyon fagofò a, LC3-I sibi lipidasyon pou l vin LC3-II, otofagozòm nan fèmen, li fizyone ak lizozòm nan, epi materyèl la degrade pandan p62 ap renouvle.
Dyagram nan mete chak rezilta sou ble metilèn sou kat sa a: rezilta sou selil ipokanp la bò branch AMPK a, rezilta sou selil pwogenitè a bò branch mTOR a.
Fason sa a pou prezante bagay yo rezoud dezakò ki te sanble genyen ak dezyèm etid Xie a. Nan selil pwogenitè neral rat ki t ap pwolifere, yon lòt eksperyans te jwenn 5 μM ble metilèn te inibe pwoliferasyon epi favorize yon eta repo, ak yon diminisyon selil pozitif pou Ki67 nan jou 1 ak 3, pandan diferansyasyon selil ki te deja angaje pou vin newòn te rete entak. La, mekanis la te pase pa sipresyon siyalizasyon mTOR: diminisyon mTOR total ak mTOR fosforile ansanm ak ekspresyon p70S6K ak 4EBP1 ki te pi ba, plis yon rediksyon siklin E1, B1, D1, ak D2. Fenotip prensipal la se te eta repo selil pwogenitè yo, otè yo te lye ak yon reta nan senesans, se pa sekou selil ipokanp ki anba estrès.
Pa gen kontradiksyon ant de atik syantifik yo. AMPK ak mTOR se entegratè ki sansib ak kontèks la, se pa entèriptè fiks. Yon selil ki sanble ak yon newòn epi ki anba estrès ka aktive AMPK san yon inibisyon mTOR yo ka mezire, tandiske yon selil pwogenitè mitojèn ap pouse grandi ka reyaji ak menm konpoze a lè li ralanti mekanis kwasans ki depann de mTOR. Kalite selil la, kontèks estrès la, konsantrasyon an, ak moman mezi a detèmine ki branch ki domine. Se poutèt sa tou efè ble metilèn sou enèji mitokondriyal ak reyaksyon redoks fè pati menm tablo a: jan yon revizyon sou mekanis newopwoteksyon yo dekri sa, konpoze a aji kòm yon transpòtè elektwon altènatif, li aktive siyalizasyon antioksidan ak anti-apoptotik, li inibe MAO ak NOS, epi li konekte ak renouvèlman mitokondri atravè byojenèz ak otofaji. Otofaji se yon branch nan yon pwofil ki gen plizyè efè, se pa tout istwa a.
Sa eksperyans yo pa montre
Privasyon sewòm sèvi kòm modèl estrès twofik ak metabolik nan yon veso kilti. Li pa sèvi kòm modèl jèn pou yon òganis antye: glikoz, asid amine, ak sèl rete nan milye baz la, epi pa gen konpòtman alimantè. Yo pa ka konvèti konsantrasyon kilti ki soti nan 20 nM rive nan 5 μM an dòz pou moun ak yon kalkil aritmetik, paske absòpsyon, lyezon ak pwoteyin, eta redoks, metabolis, akimilasyon nan tisi, ak dire ekspozisyon diferan.
Pa gen okenn esè sou moun ki te fèt pou demontre yon fliks otofajik ble metilèn pwovoke nan pasyan. Prèv sou mekanis yo toujou soti nan travay sou selil, ex vivo, ak sou bèt, epi revizyon yo toujou dekri prèv pou aplike rezilta sa yo nan klinik kòm preliminè. Kidonk, etid sa yo pa montre ble metilèn repwodui jèn, pwolonje dire lavi moun atravè otofaji, oswa fè fliks otofajik la rive jouk nan bout nan sèvo moun. Deklarasyon sou imitasyon jèn ak lonjevite bezwen pwòp prèv klinik yo, epi esè ble metilèn sou moun pou lòt endikasyon pa vin tounen esè otofaji senpleman paske gen yon lyen ant yo. Rechèch sou modèl estrès nitrisyonèl ak lonjevite dwe li avèk limit sa a nan tèt ou.
Pou pwochen atik syantifik ou li a, aplike lis verifikasyon an nan lòd. Premye kesyon an se ki branch ki te chanje: AMPK, mTOR, oswa okenn nan yo. Apre sa, mande si rezilta LC3 a te akonpaye ak yon tès fliks oswa si li te poukont li. Apre sa, verifye si bloke chemen an te retire benefis la, epi ak ki metòd. Yon etid ki reponn tout twa kesyon yo gen baz pou fè yon deklarasyon solid sou mekanis la. Yon etid ki reponn sèlman premye a montre yon siyal otorizasyon, epi rès trajè a poko trase.