Poukisa yo sèvi ak ble metilèn kòm kontrakoloran nan kolorasyon asidorezistan

Yon teknisyen egzamine yon fwoti krache apre tout etap kolorasyon yo. Basil wouj yo parèt klè sou yon fon ble, epi rapò a soti ak rezilta: yo wè basil asidorezistan. Nan demen, yon lòt lam montre yon fon ble inifòm san okenn basil wouj, epi yo rapòte li kòm negatif pou tibèkiloz. Youn nan rapò sa yo di plis pase sa lam nan pèmèt afime, epi se pa premye a.

Konfizyon an soti nan fason yo konprann prensip la. Teknisyen an te konsidere koloran ble a kòm yon pati nan chimi deteksyon an, kòmsi ble metilèn te ede jwenn mikobakteri yo. Se pa sa li te fè. Lè ble metilèn touche lam nan, tès la deja fini. Koloran an sèlman kolore fon an pou rezilta a ka lizib. Atik sa a esplike wòl ble metilèn nan kolorasyon asidorezistan, poukisa se ble olye yon lòt koulè, epi ki konklizyon wouj sou ble pèmèt ou tire.

Repons kout la

Kolorasyon asidorezistan se yon tès diferansyèl ki baze sou twa lide. Yo fòse fiksin fenike, koloran prensipal la, antre nan chak selil, ansanm ak mikobakteri ki gen yon anvlòp ki sanble ak sir. Asid-alkòl, dekoloran an, retire koloran wouj la nan selil òdinè yo, men li pa rive retire l nan selil asidorezistan yo. Apre sa, ble metilèn, kontrakoloran an, kolore tout sa dekoloran an te vide, konsa selil ki pa asidorezistan, selil òganis ki resevwa mikwòb la ak debri parèt ble pandan basil asidorezistan yo rete wouj. Kontrakoloran an bay kontras. Li pa jwe okenn wòl nan chimi ki fè yon selil asidorezistan.

Sa chak etap fè

Dyagram ki anba a montre kijan travay la separe. Li l de goch a dwat kòm yon pwosedi, epi li bann ki anba a kòm yon rapèl ke chak fanmi kolorasyon poze yon kesyon diferan.

Penetrasyon vini an premye. Mikobakteri reziste koloran ake òdinè yo paske anvlòp yo gen yon kapasite ki pa nòmal pou repouse dlo, kidonk pwotokòl la fòse koloran an antre. Nan metòd Ziehl-Neelsen an, chofaj ki pwodui vapè pouse fiksin fenike ki gen fenòl la atravè miray ki sanble ak sir la. Nan metòd frèt Kinyoun nan, yon fòmil koloran prensipal ki pi fò anpil ranplase chalè a, epi kèk vèsyon modifye san chalè ajoute ajan sifas-aktif. Pwotokòl kolorasyon asidorezistan American Society for Microbiology yo prezante toude fòmil yo youn bò lòt, epi diferans konsantrasyon an frapan: apeprè 0.3 g fiksin bazik pou chak 100 mL nan metòd ak chalè a, kont apeprè 4 g nan metòd frèt la.

Diferansyasyon vini an dezyèm. Asid-alkòl, ki souvan fèt ak 3 mL asid kloridrik konsantre nan 97 mL etanòl a 95 pousan, lave koloran wouj la soti nan chak selil ki gen yon miray ki pa ofri okenn rezistans espesyal. Selil ki gen anvlòp lipidik mikobakteri yo entak kenbe koloran an. Se etap sa a tout metòd la depann de li, epi se etap ki pi sansib a fason yo egzekite teknik la, jan nou diskite pi ba a.

Kontras vini an dènye. Kounye a, lam nan gen selil asidorezistan wouj sou yon fon prèske san koulè ki fèt ak selil ki pèdi koloran yo. Ble metilèn a 0.3 pousan w/v fè fon sa a vizib ankò nan yon koulè ki diferan otank posib de wouj. Kontrakolorasyon an kout, anjeneral 20 a 30 segonn nan metòd ak chalè a, epi jiska kèk minit nan kèk varyant metòd frèt la. Dire a depann de pwotokòl la olye li se yon pwopriyete koloran an li menm.

Poukisa koloran sa a, epi poukisa ble

Ble metilèn se yon koloran bazik kasyonik, sa vle di iyon ki bay koulè li a pote yon chaj pozitif epi li fikse sou sifas ki gen chaj negatif nan bakteri dekolore yo, selil òganis ki resevwa mikwòb la ak debri. Mikwobyoloji OpenStax dekri lojik chaj sa a kòm prensip jeneral ki dèyè koloran bazik yo. Men ble metilèn pa gen anyen ki inik sou plan chimik nan ka sa a. Vyolèt kristal ak safranin se koloran bazik tou. Chwa a baze sou optik, pa sou chimi.

Basil wouj yo bezwen yon fon ki gen yon koulè ki bay kontras, epi ble opoze ak wouj nan fason ki pi itil pou mikwoskopi ak chan klè. Safranin ta yon move kontrakoloran paske koulè woz-wouj li bay nan fen an twò pre koulè fiksin fenike ki rete nan selil yo, sa ki efase diferans pwosedi a te kreye a. Vyolèt kristal ta bay yon fon vyolèt fonse ki fè konpetisyon ak basil wouj mens yo pou atire je a. Prèv ki pi fò ki montre travay la se bay kontras olye li se chimi se posiblite ranplasman an: kontrakoloran vèt tankou vèt malakit ak vèt briyan sèvi nan kèk pwotokòl veterinè ak pwotokòl modifye, epi tès la toujou mache, paske nenpòt koulè ki klèman diferan fè menm travay la.

Sa gen de konsekans pratik. Premyèman, resèt estanda a pa mande okenn ajisteman pH; pa konfonn solisyon ake senp sa a a 0.3 pousan ak fòmil alkalin tankou ble metilèn Loeffler la, ki fè pati yon lòt prensip kolorasyon. Dezyèmman, mete twòp fè mal. Literati istoloji a avèti espesyalman ke yon fon ble ki twò entans ka kache basil ki ra yo, kidonk kite lam nan kouvri ak koloran an pi lontan pase pwotokòl la pèmèt diminye lizibilite san okenn avantaj.

Chimi miray la ki rann tès la posib

Rezon ki fè asid-alkòl ka fè diferans lan chita nan anvlòp mikobakteri yo. Nwayo estriktirèl li se konplèks mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan an: peptidoglikan ki lye ak arabinogalaktan, kote pwent ekstèn yo pote asid mikolik ak chèn trè long, ki fòme yon mikomanbràn ekstèn rich an lipid ak yon pèmeyabilite ki ba anpil. Revizyon sou manbràn ekstèn mikobakteri yo bay detay sou achitekti sa a. Baryè a travay nan toude sans. Li reziste antre koloran an, se poutèt sa penetrasyon an bezwen chalè oswa yon koloran prensipal ki pi fò, epi li reziste ekstraksyon koloran an, se poutèt sa asid-alkòl pa rive retire fiksin fenike a yon fwa li anndan. Bakteri òdinè yo pa gen anvlòp sa a epi yo pèdi koloran an. Se poutèt sa, pi bon fason pou konprann asidorezistans lan se kòm yon fenomèn baryè lipidik, pa kòm fiksin ki lye chimikman ak asid mikolik.

Chimi sa a esplike tou yon bagay ki souvan bay konfizyon: mikobakteri yo pran kolorasyon Gram lan mal epi yon fason ki pa previzib; pafwa yo parèt kòm fòm pal ki sanble ak yon seri ti grenn, oswa kòm silwèt san koulè. Miray idrofob yo limite penetrasyon vyolèt kristal la. Kolorasyon asidorezistan pa yon kolorasyon Gram modifye. Li se yon lòt prensip diferansyèl ki baze sou yon lòt pwopriyete miray la, jan konparezon ant kolorasyon senp ak kolorasyon Gram lan montre pou de lòt metòd yo.

Twa metòd, twa kesyon

Pou fanmi metòd bakteryen ki sèvi ak yon sèl koloran an nan yon sans pi laj, gade atlas kolorasyon pou mikwoskopi a.

Sa wouj sou ble pa kapab pwouve

Basil wouj yo vle di òganis yo te kenbe fiksin fenike a malgre asid-alkòl la. Obsèvasyon sa a ann akò ak Mycobacterium tuberculosis, men gid CDC pou dyagnostik tibèkiloz la di klèman lòt mikobakteri asidorezistan tou, kidonk idantifikasyon espès la mande kilti ak tès asid nikleyik, pa koulè.

Erè teknik yo konsantre bò de etap lavaj yo. Dekolorasyon ki pa ase kite materyèl nan fon an wouj epi li favorize lekti fo pozitif. Twòp dekolorasyon retire koloran prensipal ki te rete fèbman fikse a epi li kontribye nan fo negatif. Yon kontrakoloran yo mete twòp antere basil ki ra yo nan ble. Fwoti epè, reyaktif ki presipite ak dlo rense ki kontamine ajoute pwòp artefak pa yo.

Sansiblite a limite pa kantite òganis ki prezan, menm lè teknik la fèt byen. Mikwoskopi fwoti konvansyonèl bezwen apeprè 5,000 a 10,000 basil pou chak mililit krache, epi ansyen revizyon prèv CDC yo te mete sansiblite fwoti a nan anviwon 45 a 80 pousan pami ka tibèkiloz poumon kilti te konfime. Kidonk, yon fwoti negatif pa janm eskli tibèkiloz. Gid CDC aktyèl la kenbe kilti ansanm ak chak fwoti epi li rekòmande tès anplifikasyon asid nikleyik sou omwen yon echantiyon respiratwa lè yo konsidere tibèkiloz poumon epi rezilta a ta chanje fason yo jere ka a.

Travay pratik dwe suiv pwotokòl otorize

Deskripsyon pou ansèyman, tankou atik sa a, pa bay otorizasyon pou travay klinik. Pou travay pratik nan laboratwa, suiv pwosedi operasyon estanda laboratwa a ki valide epi ki ann akò ak dokiman CDC, APHL oswa CLSI aktyèl yo; referans CDC sou kolorasyon asidorezistan ki nan achiv Stacks li a montre kijan pwosedi sa yo presize reyaktif yo ak fason pou li rezilta yo. Travay sou echantiyon tibèkiloz mande mezi pou anpeche ajan biyolojik yo gaye: yo prepare fwoti yo nan yon kabinè sekirite biyolojik paske preparasyon an pwodui ayewosòl ak pwojeksyon likid, epi gid CDC sou sekirite laboratwa a di menm fwoti ki fikse ak chalè ka gen basil tibèkiloz ki vivan toujou, e yo dwe toujou manipile yo kòm materyèl kontamine. Antre nan Bibliyotèk Imaj Sante Piblik CDC a pou yon fwoti ak fiksin fenike ak ble metilèn yo egzamine pou M. leprae se yon rapèl itil sou itilizasyon metòd la pi lwen pase tibèkiloz: menm kontras wouj sou ble a itil nenpòt kote y ap chèche òganis asidorezistan, epi yon lekti negatif ki fèt ak anpil atansyon se li menm yon rezilta ki merite anrejistre.

Lekti lam ki fini an

Kontrakoloran an montre itilite li pandan egzamen depistaj la. Yon mikwoskopis k ap egzamine lam nan ak ti agrandisman sèvi dabò ak fon ble a pou evalye kalite fwoti a: distribisyon selil yo regilye, selil òganis ki resevwa mikwòb la entak pou fè ajisteman fokis, pa gen gwo kantite presipite. Apre sa, eleman wouj ki ka basil yo atire je a jisteman paske pa gen lòt bagay wouj sou lam nan. Konfimasyon fèt anba imèsyon nan lwil, kote vrè basil yo montre fòm baton mens yo atann lan, pafwa yon ti jan koube oswa tankou yon seri ti grenn, olye yo sanble ak debri koloran inifòm.

Kolorasyon fon an defini tou vokabilè rapò a. Yo rapòte yon lam ki gen basil wouj kòm: yo wè basil asidorezistan, souvan ak yon klasman semikantitatif selon echèl laboratwa a. Yo rapòte yon lam ki pa gen òganis wouj kòm: yo pa wè okenn basil asidorezistan, pa janm kòm negatif pou tibèkiloz. Diferans lan enpòtan paske chan ble a pwouve kolorasyon an te mache, selil yo te pran kontrakoloran an epi kondisyon optik yo te apwopriye, pandan li pa di anyen sou òganis ki anba limit deteksyon an. Yon chan ble san basil se yon rezilta valab sou lam nan, pa yon vèdik sou pasyan an.

Sonje kijan travay la separe, epi rapò yo ap fasil pou ekri. Fiksin fenike detekte kandida yo. Asid-alkòl fè tès la. Ble metilèn sèlman rann repons lan lizib: sa ki wouj te kenbe koloran an malgre asid la, sa ki ble te pèdi l. Tout rès la, espès, kantite òganis ak siyifikasyon klinik, soti nan travay ki fèt pi lwen pase lam nan.