Znači li veća potrošnja kisika više ATP-a? Pouke iz istraživanja metilenskog modrila

Izolirani mitohondrij nalazi se u komori s gorivom, ali bez ADP-a. Polako troši kisik. Dodavanjem ADP-a potrošnja kisika višestruko poraste. Kada se ADP potroši, potrošnja kisika ponovno opada. Gorivo se nije promijenilo. Promijenila se samo potreba za ATP-om.

Taj kratki slijed događaja sažima cijelu razliku kojom se ovaj članak bavi. Potrošnja kisika mjeri koliko brzo elektroni prolaze kroz respiracijski lanac do kisika. Proizvodnja ATP-a mjeri koliko se tog protoka pohranjuje kao iskoristiva energija. Povezuje ih međukorak, protonski gradijent preko unutarnje mitohondrijske membrane, a sve što mijenja čvrstoću sprege između gradijenta i sinteze ATP-a može te dvije krajnje veličine pomaknuti u različitim smjerovima. Metilensko modrilo ovdje je poučan primjer jer je zabilježeno da djeluje na oba načina: u nekim pripravcima povećava potrošnju kisika zajedno s ATP-om, a u drugima povećava potrošnju kisika dok ATP ostaje nepromijenjen ili opada.

Čitatelji koji najprije žele širu sliku prijenosa mogu početi od objašnjenja kako metilensko modrilo prenosi elektrone kroz respiracijski lanac, a oni koji žele upoznati pojmove iz ranih pokusa s kisikom mogu pročitati što su prva mjerenja respiracije zapravo pokazala.

Respiracija, ATP i gradijent između njih

Elektroni iz NADH i FADH2 ulaze u lanac na kompleksima I i II, prolaze kroz kompleks III do citokroma c, a zatim kroz kompleks IV do kisika. Energija oslobođena na kompleksima I, III i IV pokreće pumpanje protona iz matriksa u međumembranski prostor. To razdvajanje naboja i kiselosti čini protonsku pokretačku silu, a njezin električni dio, membranski potencijal, obično je dominantan.

ATP-sintaza omogućuje protonima povratak u matriks i koristi oslobođenu energiju za spajanje ADP-a i fosfata u ATP. Dakle, slijed je:

potrošnja kisika, zatim pumpanje protona, zatim gradijent, zatim sinteza ATP-a.

Problem je u tome što se protoni mogu vratiti i drugim putovima. Svaki povratak koji zaobilazi ATP-sintazu predstavlja propuštanje protona. Propuštanje prisiljava lanac da ponovno pumpa iste protone kako bi održao membranski potencijal stabilnim, čime se troši više kisika bez stvaranja više ATP-a. Dovoljno snažno propuštanje dovodi do rasprezanja: potrošnja kisika raste dok ATP ostaje nepromijenjen ili opada, a izgubljena energija oslobađa se kao toplina.

Stanje 3, stanje 4 i omjer respiracijske kontrole

Klasični pojmovi koji to opisuju potječu iz istraživanja izoliranih mitohondrija. Stanje 3 je respiracija u prisutnosti supstrata i ADP-a: ATP-sintaza smanjuje gradijent, membranski potencijal opada, lanac ubrzava kako bi ga obnovio, a potrošnja kisika visoka je jer se stvara ATP. Stanje 4 je respiracija nakon što se ADP potroši: ATP-sintaza miruje, gradijent raste, visoki membranski potencijal otežava daljnje pumpanje, a potrošnja kisika pada na razinu potrebnu za nadoknađivanje propuštanja.

Omjer respiracijske kontrole, stanje 3 podijeljeno sa stanjem 4, stoga pokazuje koliko je čvrsta sprega u pripravku. Visok omjer znači da ADP snažno kontrolira respiraciju. Pad omjera uz porast respiracije u stanju 4 znači da propuštanje preuzima glavnu ulogu. Iz te perspektive rezultati s metilenskim modrilom navedeni u nastavku postaju razumljivi.

Vrijedi zapamtiti jedan misaoni model. Visoki membranski potencijal usporava lanac. Rasipanje potencijala ubrzava ga. Lanac reagira na to koliko je pumpanje postalo teško, a ne izravno na to stvara li se ATP.

Kada se krajnje veličine mijenjaju zajedno

Najjasniji primjer sprege dolazi iz istraživanja izoliranih mitohondrija mozga zamorca s blokiranim respiracijskim kompleksima. Pri koncentracijama metilenskog modrila od 100 nanomolara do 1 mikromolara potrošnja kisika u mirovanju porasla je uz glutamat i malat, sukcinat ili glicerofosfat kao gorivo, dok je respiracija potaknuta ADP-om ostala nepromijenjena. U mitohondrijima otrovanima na kompleksu I ili kompleksu III bojilo je umjereno povećalo proizvodnju ATP-a, obnovilo membranski potencijal i poboljšalo unos kalcija. Predloženi put je prečac: bojilo prima elektrone prije mjesta blokade i predaje ih citokromu c, zaobilazeći oštećeni kompleks.

Drugi primjer zajedničkog porasta koristi posve drukčiji izvor ATP-a. U izoliranim mitohondrijima mozga s inhibiranom ATP-sintazom metilensko modrilo i dalje je poticalo respiraciju na svakom ispitanom supstratu. No sinteza ATP-a porasla je samo na alfa-ketoglutaratu i glutamatu, dvama supstratima iz kojih nastaje sukcinil-CoA. Kada je oligomicin blokirao ATP-sintazu, dodatni ATP nastajao je fosforilacijom na razini supstrata djelovanjem sukcinil-CoA ligaze u ciklusu limunske kiseline, a ne oksidativnom fosforilacijom. Bojilo je također obnovilo membranski potencijal kada su kompleks I i ATP-sintaza bili istodobno inhibirani. Ovdje su se potrošnja kisika i ATP povećavali zajedno, ali samo ondje gdje je supstrat omogućavao drugi put stvaranja ATP-a. Na sukcinatu ili malatu respiracija je porasla bez dodatnog ATP-a. Isto bojilo, ista komora, drukčije gorivo, drukčiji odgovor.

Kada se krajnje veličine razilaze

Primjeri razilaženja također su objavljeni i jednako poučni. U istraživanju izoliranih mitohondrija jetre štakora iz 1997 metilensko modrilo ubrzalo je respiraciju u stanju 4 u čvrsto spregnutim mitohondrijima koji su respirirali koristeći sukcinat, što je snizilo omjer respiracijske kontrole. Učinak je bio vidljiv već pri 0.5 mikromolara, a snažan pri 5 mikromolara, koncentraciji bliskoj razinama u plazmi nakon intravenskog bolusa od 100 miligrama. Pri 5 mikromolara mitohondriji su također nabubrili, no poremećaj sprege pojavio se ranije, pri nižim koncentracijama, što upućuje na to da je propuštanje prethodilo strukturnom oštećenju, a ne da je nastalo zbog njega. U rasprezanim mitohondrijima bojilo je poticalo respiraciju na način koji je ovisio o koncentraciji i dosezao zasićenje. Potrošnja kisika porasla je u oba pripravka. Sinteza ATP-a po količini potrošenog kisika nije. To je školski primjer rasprezanja i prijenosa elektrona u istoj molekuli.

Najupečatljivije razilaženje dolazi iz mrežnice. U miševa s nedostatkom AIF-a i fotoreceptorskih stanica tretiranih rotenonom metilensko modrilo očuvalo je debljinu mrežnice, fotoreceptorske biljege i strukturu mitohondrija te smanjilo omjer NADH prema NAD i ublažilo aktivnost putova stresa, uključujući odgovor na nesmotane proteine i mitofagiju. To je postiglo bez ispravljanja manjka ATP-a. Zaštita bez obnovljene energije znači da je korist ostvarena putem redoks ravnoteže i očuvanosti mitohondrija, a ne dodatnim ATP-om. Svatko tko bi opstanak tkiva izjednačio s obnovljenom proizvodnjom energije potpuno bi pogrešno protumačio taj pokus.

Istraživanja mitohondrija mozga toj istoj bilanci dodaju i trošak. Iste niske koncentracije koje su poboljšale bioenergetiku također su povećale stvaranje vodikova peroksida u svim ispitanim uvjetima i usporile njegovo uklanjanje, što je izmjereno kalibriranim testom Amplex, a ne nespecifičnim bojilom. Više ATP-a i više oksidansa pojavili su se zajedno.

Praktični kontrolni popis za čitanje

Četiri pitanja razlikuju spregnuti rezultat od rasprezanog.

Prvo, koja je krajnja veličina doista izmjerena. Sama potrošnja kisika ne može dati podatak o ATP-u. Sinteza ATP-a, membranski potencijal i omjer respiracijske kontrole svaki dodaju dio slike koji kisikova elektroda ne može vidjeti. Vodič za čitanje tvrdnji iz istraživanja metilenskog modrila detaljno objašnjava taj disciplinirani pristup krajnjim veličinama.

Drugo, koji je supstrat hranio mitohondrije. Rezultat sa sukcinil-CoA pokazuje da izbor goriva može odrediti može li se dodatna respiracija uopće pretvoriti u dodatni ATP.

Treće, koja je koncentracija korištena. Metilensko modrilo u nanomolarnim do niskim mikromolarnim koncentracijama u mitohondrijima mozga donijelo je umjerene bioenergetske dobitke uz oksidacijski trošak; pola mikromolara i više u mitohondrijima jetre oslabilo je spregu; 5 mikromolara dovelo je i do bubrenja. Koncentracija je dio mehanizma, a ne usputni detalj.

Četvrto, u kojem je modelu dobiven rezultat. Izolirani mitohondriji otkrivaju povezanost mehanizama, ali cjelovite stanice i tkiva dodaju transport, redukciju u bezbojni oblik i konkurentska odredišta za elektrone. Laboratorijska istraživanja doziranja, uključujući to kako koncentracija i protokol oblikuju učinke metilenskog modrila, povezuju vrijednosti iz komore s bilo kakvom tvrdnjom o čovjeku.

Potrošnja kisika pokazuje protok elektrona. ATP pokazuje koliko je energije iz tog protoka pohranjeno. Metilensko modrilo može promijeniti bilo koju od tih veličina, a navedeni pokusi pokazuju sve četiri kombinacije koje iz toga proizlaze: obje rastu, respiracija raste uz dodatni ATP samo ondje gdje to supstrat dopušta, respiracija raste dok sprega slabi i tkivo se očuva dok ATP ostaje nepromijenjen. Broj na kisikovoj elektrodi početak je tumačenja, a ne njegov kraj.