Metilensko modrilo u istraživanjima moždanog udara i cerebralne hipoperfuzije: što tri modela doista pokazuju

Začepljena arterija, stanična kultura bez hranjivih tvari i štakor sa suženim vratnim arterijama zvuče kao tri inačice istog pokusa. Nisu. Svaki postavlja drukčije pitanje, a metilensko modrilo u svakom daje drukčiji odgovor. Ako ih pomiješamo, literatura izgleda proturječno. Ako ih razdvojimo, pojavljuje se jasan obrazac koji uglavnom određuje vrijeme primjene.

Upravo je to razdvajanje smisao ovog pregleda. Tri modela obuhvaćaju akutni žarišni moždani udar, nedostatak kisika i glukoze s ponovnom oksigenacijom u kultiviranim stanicama te kroničnu cerebralnu hipoperfuziju tijekom više tjedana. Predloženi mehanizam koji ih povezuje djeluje u mitohondrijima, ali ishodi se razlikuju jer se razlikuje metabolički kontekst.

Tri modela odgovaraju na različita pitanja

Akutni žarišni moždani udar u štakora obično se izaziva okluzijom srednje moždane arterije, skraćeno MCAO. Začepljenje nalik ugrušku stvara ishemijsku jezgru okruženu penumbrom, tkivom koje je ugroženo, ali se potencijalno može spasiti ako se protok obnovi. Ovdje je pitanje usporava li intervencija rast infarkta ili čuva funkciju u razdoblju oko reperfuzije.

Uskraćivanje kisika i glukoze, skraćeno OGD, odvija se na suprotnoj razini. Kultivirane moždane stanice stavljaju se u uvjete s gotovo nimalo kisika i bez glukoze, a zatim se vraćaju u normalan medij. Nema ugruška, kolateralne cirkulacije, krvnog tlaka ni imunosnog sustava. Pitanje je isključivo stanično: što se događa s respiracijom, ATP-om i preživljenjem kada supstrati nestanu pa se vrate.

Model kronične cerebralne hipoperfuzije koristi trajnu obostranu okluziju karotidnih arterija u štakora i naziva se modelom 2VO. Protok krvi u prednjem mozgu smanjuje se i ostaje nizak tjednima. Nema iznenadnog žarišnog infarkta ni hitne reperfuzije. Pitanje je čuva li višetedna metabolička potpora krvne žile, mitohondrije i pamćenje tijekom dugotrajno smanjenog protoka.

Poboljšanje pamćenja nakon jednog mjeseca liječenja u modelu 2VO stoga ne govori ništa izravno o spašavanju ljudskog mozga tijekom hitne trombektomije. Ta je razlika važna jer je većina optimističnih sažetaka preskače.

Akutni moždani udar: zaštita pri reperfuziji, odgoda bez nje

Najjasniji akutni rezultat dolazi iz prolazne MCAO s reperfuzijom. Štakori su bili podvrgnuti okluziji tijekom 60 minuta, a zatim su primali malu dozu metilenskog modrila intravenozno, počevši od reperfuzije, uz dodatne doze nakon 3 sata i 2. dana. MRI je pokazao da se lezija u skupini koja je primala samo nosač do 2. dana povećala za oko 19 posto, dok se lezija u liječenoj skupini smanjila za oko 17 posto, uz približno 30 posto manje konačne infarkte i bolje neurološke rezultate 2. i 7. dana. Slikovne pretrage pokazale su bolje očuvanje tkiva i jezgre i penumbre. Šira literatura o neuroprotekciji razmatra tu zaštitu vezanu uz vrijeme reperfuzije zajedno s nalazima iz globalne ishemije i traume.

Slika se mijenja kada arterija ostane začepljena. U pokusu s trajnom MCAO metilensko modrilo primijenjeno tijekom ishemije usporilo je širenje lezije na difuzijskim snimkama i nakratko produljilo nepodudarnost perfuzije i difuzije, uz nešto bolji lokalni protok, ali konačni volumen infarkta nakon 24 sata nije se značajno razlikovao. Odgodilo je pretvaranje ugroženog tkiva u infarkt, ali nije zamijenilo ponovno otvaranje krvne žile.

Treće istraživanje akutnog moždanog udara dodaje pojedinosti o mehanizmu i dozi. Jednokratna intraperitonealna doza neposredno nakon okluzije pokazala je najveće smanjenje infarkta, oko 50 posto, pri srednjoj dozi od 5 mg/kg, a ne pri 1 ili 10 mg/kg, uz bolje senzomotoričke rezultate. Autori su to povezali s očuvanom strukturom mitohondrija i pojačanom mitofagijom, selektivnim uklanjanjem oštećenih mitohondrija. Doza, put primjene i raspored stoga su važni, a vrijednosti u mg/kg za štakore nisu doze za liječenje moždanog udara u ljudi.

Stanična kultura: isti lijek pomaže ili šteti ovisno o vremenu primjene

Pokus s astrocitima najpoučniji je i najčešće pogrešno citiran. Primarni kortikalni astrociti miša bili su izloženi teškom nedostatku tijekom 6 sati, pri 0.1 posto kisika u mediju bez glukoze, piruvata ili seruma, nakon čega su slijedila 24 sata ponovne oksigenacije uz obnovljenu dostupnost supstrata. Uginula je približno polovica stanica, što tom testu ostavlja prostor za prikaz učinka u oba smjera.

Kada je metilensko modrilo bilo prisutno tijekom faze nedostatka, preživljenje se pogoršalo, a ne poboljšalo. Kada je umjesto toga uvedeno pri ponovnoj oksigenaciji, niske mikromolarne koncentracije poboljšale su vijabilnost te povećale potrošnju kisika, unos glukoze i proizvodnju ATP-a. U normalnim uvjetima iste su koncentracije povećale unos glukoze za približno 89 posto pri 0.1 mikromolar i oko 200 posto pri 1 mikromolar, uz očuvan glikogen i aktivnost heksokinaze nakon ozljede te bez izmjerenog porasta superoksida.

Mehanizam je lakše razumjeti usporedbom s rezervnim generatorom. Metilensko modrilo djeluje kao alternativni prijenosnik elektrona koji prihvaća redukcijske ekvivalente i prenosi ih prema citokromu c i kompleksu IV, čime podupire protok elektrona i sintezu ATP-a, a istodobno smanjuje istjecanje elektrona u ranijim dijelovima lanca. Tijekom teškog nedostatka ta je stimulacija nepovoljna jer povećava metaboličke potrebe kada kisika i glukoze gotovo nema, što može brže iscrpiti posljednje zalihe. Nakon povratka supstrata isto svojstvo postaje prednost jer pomaže oštećenim mitohondrijima da učinkovito iskoriste ponovno dostupne kisik i glukozu. Zato nalaze iz objašnjenja mitohondrijskog prijenosa elektrona također treba promatrati u kontekstu nedostatka supstrata.

Jedno upozorenje: ovo pravilo o vremenu primjene vrijedi za taj pripravak astrocita. Povezano stanično istraživanje s drugom vrstom stanica, blažim nedostatkom i nižom koncentracijom utvrdilo je zaštitu čak i pri izlaganju tijekom nedostatka. Vrsta stanica, preostali kisik, koncentracija i protokol određuju smjer učinka.

Kronično smanjen protok: pamćenje, citokrom-oksidaza i krvne žile tijekom više tjedana

U kroničnim pokusima primjenjivane su male doze svakodnevno tijekom više tjedana, a ne jedan hitni bolus. U prvom istraživanju štakori s trajnom okluzijom karotidnih arterija primali su 4 mg/kg dnevno tijekom jednog mjeseca, nakon svakog dnevnog treninga, kako bi se djelovalo na konsolidaciju pamćenja, a ne na trenutačnu izvedbu. Životinje s okluzijom sporije su učile zadatke vizualnog razlikovanja i imale lošije rezultate na zahtjevnom testu pamćenja, dok sposobnost plivanja, motorička aktivnost i prepoznavanje mirisa nisu bili promijenjeni. Svakodnevna primjena ublažila je teškoće u učenju i pamćenju bez promjene općeg motoričkog ponašanja.

Naknadno istraživanje mapiralo je citokrom-oksidazu, odnosno mitohondrijski kompleks IV, u 44 moždane regije nakon istog jednomjesečnog režima. Okluzija je smanjila aktivnost enzima u vidnom, prefrontalnom i peririnalnom korteksu te hipokampusu i amigdali, a oslabila je i usklađenu aktivnost između vidnog korteksa i hipokampusa. Primjena je očuvala regionalnu aktivnost enzima i ojačala te međuregionalne metaboličke korelacije, a očuvana aktivnost bila je povezana s boljom izvedbom zadataka. Te korelacije opisuju usklađenu aktivnost metaboličkih enzima, a nisu izravne mjere funkcionalne povezanosti u ljudi, što pregledi energetskog metabolizma mozga pomažu jasno razlikovati.

U zasebnom jednotjednom istraživanju primjenjivano je 2 mg/kg dnevno, a za ispitivanje mehanizma dodan je inhibitor signalnog puta. Cerebralni protok krvi uz primjenu porastao je s oko 60 na oko 100 mL na 100 g u minuti, a gustoća krvnih žila u hipokampusu s oko 15.1 na 23 posto. Oba su poboljšanja djelomično poništena kada je blokiran signalni put preživljenja PI3K/Akt, a količina fosforiliranog Akt-a porasla je uz primjenu. Nalazi o protoku krvi, gustoći krvnih žila, barijeri i neuronima upućuju na neurovaskularnu zaštitu povezanu sa signalizacijom PI3K/Akt, a ne na isključivo metabolički učinak.

Zašto ništa od toga nije isto što i hitno zbrinjavanje moždanog udara

Kontrolirani laboratorijski uvjeti razlog su zbog kojeg se ti rezultati ne mogu izravno prenijeti u kliničku praksu. Kultivirane stanice nemaju tromb ni farmakokinetiku. Model 2VO predstavlja dugotrajno globalno smanjenje protoka, a ne iznenadni žarišni embolus s penumbrom nastalom prije nekoliko minuta. Čak se i u štakorskom modelu MCAO koriste mlade zdrave životinje, anestezija, ujednačene okluzije i precizno vremenski određena primjena doza, za razliku od starijih bolesnika s različitim ugrušcima, aterosklerozom, hipertenzijom, dijabetesom i nepoznatim vremenom početka.

Nijedno objavljeno randomizirano ispitivanje na ljudima nije potvrdilo metilensko modrilo kao hitno liječenje akutnog ishemijskog moždanog udara. Jedno povremeno citirano slikovno istraživanje na ljudima uključilo je 26 zdravih odraslih osoba, a ne bolesnike s moždanim udarom, te je jednokratna oralna doza promijenila moždane signale povezane sa zadatkom uz malo poboljšanje prisjećanja. To pokazuje djelovanje u središnjem živčanom sustavu, a ne učinkovitost kod moždanog udara. Aktualne smjernice za hitno zbrinjavanje umjesto toga usmjerene su na brzu reperfuziju intravenoznom trombolizom u bolesnika koji ispunjavaju kriterije i trombektomijom kod odgovarajućih okluzija velikih krvnih žila, a standardni postupci hitnog zbrinjavanja moždanog udara ostaju jedini dokazani put. Kod sumnje na moždani udar zbrinjavanje se nikada ne smije odgađati radi primjene metilenskog modrila, a praktična ograničenja ekstrapolacije pretkliničkih doza objašnjavaju zašto se rasporedi primjene u štakora ne mogu tumačiti kao klinički režimi.

Sigurnosni aspekti dodatno naglašavaju tu granicu. Intravenozno metilensko modrilo nosi istaknuto upozorenje u okviru o ozbiljnom ili smrtonosnom serotoninskom sindromu pri kombiniranju sa serotonergičkim lijekovima, uključujući SSRI-je, SNRI-je i inhibitore MAO, koje uzimaju mnogi bolesnici u dobi u kojoj se javlja moždani udar. Kontraindicirano je kod nedostatka G6PD-a zbog rizika od hemolize. Također inhibira signalizaciju dušikova oksida, što u nekim okolnostima povećava vaskularni otpor i tlak, pa ga ne treba opisivati jednostavno kao lijek koji povećava protok krvi u mozgu. Odobreni intravenozni režim od 1 mg/kg za stečenu methemoglobinemiju nije režim za moždani udar.

Pošten sažetak ima uzak opseg, ali se temelji na stvarnim nalazima. U razdoblju oko reperfuzije kod prolazne žarišne ishemije metilensko modrilo u maloj dozi smanjilo je razvoj lezije u štakora. Pri trajnoj okluziji odgodilo je, ali nije spriječilo infarkt. U astrocitima je štetilo tijekom teškog nedostatka, a pomagalo pri ponovnoj oksigenaciji. Tijekom kronične hipoperfuzije očuvalo je citokrom-oksidazu, krvne žile i pamćenje tijekom više tjedana. Jedan prijenosnik, tri konteksta, tri odgovora.