Metilensko modrilo i hormeza: zašto krivulje odgovora na dozu mogu promijeniti smjer

Jedan štakor dobije 4 miligrama metilenskog modrila po kilogramu nakon što nauči prepoznavati predmet, a sljedeći ga se dan sjeća. Drugi štakor dobije 50 i jedva okreće svoj kotač za trčanje. Molekula je ista. Smjer učinka nije. Svatko tko je pročitao više od nekoliko radova o metilenskom modrilu susreo se s tim preokretom, koji ima i naziv: hormeza, dvofazni odgovor u kojem niske i visoke izloženosti pomiču isti mjereni ishod u suprotnim smjerovima.

Naziv je koristan samo ako znate što obećava, a što ne. Ovaj članak razmatra četiri objavljena skupa podataka o metilenskom modrilu, svaki s vlastitim mjerenim ishodom, rasponom koncentracija i eksperimentalnim postavom, te pokazuje zašto kemija tog bojila čini takve preokrete mogućima. Završava upozorenjem na kojem podaci inzistiraju: krivulja koja doseže vrhunac u jednom eksperimentu opis je tog eksperimenta, a ne metoda za odabir osobne doze.

Obrazac ima naziv, a taj naziv ima uže značenje nego što se čini

Pojam hormeze uveli su 1943. Southam i Ehrlich, a suvremeni kvantitativni oblik dali su mu Calabrese i Baldwin: prilagodljivi dvofazni odgovor koji nastaje izravno ili kompenzacijom nakon narušavanja homeostaze. Obratite pozornost na ono što nedostaje u toj definiciji. Riječ korisno ne pojavljuje se. Hormeza govori da krivulja mijenja smjer, ništa više.

Oblik koji vidite ovisi o tome koji je mjereni ishod na okomitoj osi. Kada je ishod pozitivna funkcija poput aktivnosti enzima, potrošnje kisika ili rezultata na testu pamćenja, poticanje pri niskim dozama praćeno inhibicijom pri visokim dozama iscrtava obrnuto U. Kada je ishod nešto nepovoljno, poput učestalosti bolesti, smanjenje pri niskim dozama praćeno povećanjem pri visokim dozama iscrtava J ili U. Isti odnos, drukčija ordinata. Većina istraživanja metilenskog modrila mjeri pozitivne funkcije, pa ovaj članak govori o krivuljama obrnutog U, uz napomenu da je slovo abecede stvar izbora pri prikazivanju podataka.

Pregledni rad iz 2008. koji je objedinio hormetičke odgovore na metilensko modrilo daje konkretan uvid u razmjere učinka. U ponašanju, fiziologiji i biokemiji odgovori unutar zone poticanja dosežu otprilike 130 do 160 posto kontrolne vrijednosti, u prosjeku oko 140, prije nego što se s daljnjim rastom doze vrate na kontrolnu vrijednost, a zatim padnu ispod nje. Taj raspon sažetak je brojnih eksperimenata, a ne svojstvo molekule. Svaka krivulja u nastavku ima vlastiti vrhunac u vlastitim jedinicama.

Zašto bi upravo ova molekula trebala promijeniti smjer učinka

Metilensko modrilo nije jednostavan donor elektrona. Ono je reverzibilni prijenosnik. Oksidirani plavi oblik prima elektrone i postaje bezbojni reducirani oblik, a reducirani oblik može te elektrone predati dalje u lancu. Prijenos elektrona koji stoji iza ovih krivulja opisan je u prikazu načina na koji metilensko modrilo prenosi elektrone, a upravo je taj prijenos ovdje ključan.

Pri niskim koncentracijama taj ciklus pruža alternativni put staničnom disanju. Reducirano bojilo može se oksidirati djelovanjem citokrom-oksidaze, završnog enzima lanca prijenosa elektrona, povećavajući brzinu njegova katalitičkog ciklusa zajedno s potrošnjom kisika i respiracijskim kapacitetom. Pri višim koncentracijama ista kemijska sklonost prihvaćanju elektrona počinje konkurirati normalnom lancu umjesto da mu pomaže: preusmjerava elektrone s njihova uobičajenog puta, izravno troši kisik i stvara reaktivne kisikove vrste umjesto korisne energije. Mala količina katalitičkog prijenosnika znači veći protok; prekomjerna količina konkurentskog odredišta za elektrone znači manji protok. Kemija čini promjenu smjera mogućom, ali ne jamči gdje će bilo koji pojedini mjereni ishod dosegnuti vrhunac.

Neovisni dokazi o ovisnosti o koncentraciji dolaze iz stanica koje uopće nemaju mitohondrije. U eksperimentima s eritrocitima iz 1976. niska koncentracija od 1 mikromolara poticala je heksoza-monofosfatni put mehanizmom koji je snažno ovisio o oksihemoglobinu, dok je stostruko viša koncentracija od 0.1 milimolara gotovo zanemarivala prisutnost oksihemoglobina i stvarala vodikov peroksid, što je potvrđeno svim trima primijenjenim metodama mjerenja. Isto bojilo, dva mehanizma, razdvojena koncentracijom. Eritrociti ne mogu provoditi mitohondrijsko disanje, pa ovo nije mitohondrijska krivulja, ali pokazuje da redoks-kemija bojila mijenja karakter s porastom koncentracije, upravo ono što mitohondrijsko objašnjenje zahtijeva.

Četiri krivulje, četiri eksperimentalna postava

Slika u nastavku prikazuje četiri skupa podataka jedan uz drugi. Svaki panel zadržava vlastite osi i uvjete jer bi njihovo preklapanje na jednoj skali bilo prva laž koju bi ovaj članak mogao iznijeti. Prikaz je shematski; točne vrijednosti i uvjeti navedeni su u tekstu.

Panel A: citokrom-oksidaza u homogenatu mozga štakora. Najjasnija mitohondrijska krivulja dolazi iz sekundarnog izvora, prikazana u preglednom radu na temelju podataka iz homogenata mozga štakora: približno 138 posto kontrolne aktivnosti pri 0.5 mikromolara, povratak na kontrolnu vrijednost pri približno 5 mikromolara i pad ispod početne vrijednosti pri približno 10 mikromolara, gdje autori pretpostavljaju da bojilo oduzima elektrone uobičajenim kompleksima lanca. Homogenat, mikromolarne koncentracije, spektrofotometrijsko mjerenje. Ta rečenica obuhvaća cijeli kontekst i krivulja izvan njega ne znači ništa.

Panel B: pamćenje štakora i trčanje u kotaču. U istraživanju pamćenja štakora učinci jednokratnih injekcija nakon učenja ispitani su 24 sata kasnije. Pri dozama od 1 do 10 miligrama po kilogramu lokomocija i hranjenje nisu se razlikovali od onih uz fiziološku otopinu, dok su doze od 50 do 100 miligrama po kilogramu izrazito smanjile trčanje u kotaču (medijan 35 naspram 279 okretaja), a najviša doza izazvala je nakostriješenost dlake, nekoordinirano kretanje i jednu smrt. Doza od 4 miligrama po kilogramu poboljšala je habituaciju i prepoznavanje predmeta: tretirani štakori proveli su gotovo 10 sekundi više istražujući novi predmet. Potrošnja kisika u mozgu porasla je i u homogenatu izloženom niskim mikromolarnim koncentracijama reduciranog bojila i u mozgovima uzetima 24 sata nakon primjene 1 miligrama po kilogramu in vivo. Uočite razliku: za ponašanje su korištene sistemske doze nakon učenja, a za potrošnju kisika koncentracije u homogenatu uz jednu dozu in vivo; riječ je o dva eksperimenta, a ne o jednoj krivulji.

Panel C: T-labirint za zebrice. U istraživanju na zebricama ribe su nakon učenja uronjene na 12 sati u kupke s nominalnim koncentracijama od 0.1, 0.5, 5.0 ili 10.0 mikromolara, uz kontrolu s plavim prehrambenim bojilom. Skupina s 0.5 mikromolara postigla je najbolje rezultate, skupina s 5.0 bila je jednaka kontroli, a skupina s 10.0 postigla je lošije rezultate od skupina s nižim dozama. Uz ovaj panel dolaze dva upozorenja. Mikromolarna koncentracija u kupki nije mikromolarna koncentracija u krvi ili mozgu; između vode u akvariju i tkiva stoje raspodjela i nakupljanje. A statistički dokazi slabiji su nego što oblik sugerira: visoka doza razlikovala se od skupina s nižim dozama, dok druge značajne razlike među skupinama nisu zabilježene. Krivulja je stvarna, ali gruba.

Panel D: heksoza-monofosfatni put u eritrocitima. Metz i suradnici usporedili su 1 mikromolar s 0.1 milimolarom u ljudskim eritrocitima u atmosferi zraka, ugljikova monoksida i smjese koja je pri fiziološkom parcijalnom tlaku kisika uzrokovala gotovo potpunu pretvorbu hemoglobina u karboksihemoglobin. Poticanje pri niskoj dozi gotovo je nestalo bez oksihemoglobina; poticanje pri visokoj dozi gotovo se nije promijenilo. Peroksid se pojavio samo pri visokoj dozi. Ovaj panel pripada uz ostale kao prikaz kemije, a ne kao četvrta točka na nekoj univerzalnoj krivulji: nema mitohondrija, koncentracije se razlikuju stostruko, a plinske smjese eksperimentalno su prilagođene.

Zašto se vrhunci ne podudaraju i zašto ni ne bi trebali

Četiri vrhunca nalaze se pri 0.5 mikromolara u homogenatu, 4 miligrama po kilogramu ubrizganih nakon učenja, 0.5 mikromolara u vodi akvarija te u usporedbi niske i visoke koncentracije u eritrocitima koje se razlikuju stostruko. Tretirati bilo koje dvije od tih vrijednosti kao isti broj znači pogrešno poistovjetiti različite kategorije. Svaki mjereni ishod ima vlastitu krivulju: optimum za pamćenje ne mora odgovarati optimumu za aktivnost oksidaze, potrošnju kisika, lokomociju ili stvaranje peroksida. Svaka jedinica koncentracije znači nešto drugo: mikromolarna koncentracija u homogenatu, nominalna mikromolarna koncentracija u kupki, sistemski miligrami po kilogramu te koncentracije u plazmi, mozgu i mitohondrijima različite su veličine, a sklonost metilenskog modrila nakupljanju u mitohondrijima i mozgu održava te razlike. Svaki model dodaje vlastitu farmakokinetiku: vrsta, put primjene i vremenski raspored određuju koje tkivo dolazi u dodir s kojom količinom bojila i koliko dugo.

Ovdje je važna i uloga doze i puta primjene u sigurnosti metilenskog modrila jer su učinci visokih doza u tim radovima — smanjena motorička aktivnost, nekoordinirano kretanje, jedan uginuli štakor, stvaranje peroksida — pokazatelji toksičnosti u vlastitim eksperimentalnim postavima, a ne sigurnosne granice za bilo koga drugoga. A svatko tko bi 4 miligrama po kilogramu u štakora želio pretvoriti u režim primjene za ljude trebao bi najprije pročitati kako se nalazi na životinjama odnose prema dokazima iz istraživanja na ljudima: jednostavna pretvorba miligrama po kilogramu između vrsta nije primjerena.

Pogreška koju treba izbjeći

Obrnuto U primamljivo je jer izgleda poput regulatora doziranja s označenom optimalnom točkom. Nije to. Hormeza opisuje što se dogodilo s jednim mjerenim ishodom u jednom eksperimentalnom postavu. Spojite četiri takva opisa i dobit ćete četiri vrhunca u četiri sustava jedinica, što je suprotnost regulatoru. Poštena uporaba tih krivulja usporedna je i upozoravajuća: očekujte da će učinci promijeniti smjer s koncentracijom, očekujte da će svaki mjereni ishod promijeniti smjer na vlastitoj točki i ne vjerujte tvrdnjama koje posuđuju vrhunac jednog eksperimenta kako bi opravdale dozu za drugu vrstu, put primjene, tkivo ili svrhu. Razlika između eksperimentalnih obrazaca i osobnih odluka o doziranju smisao je cijelog ovog članka, ponovljen još jednom kako ne bi promaknuo.

Kako čitati sljedeći rad o odgovoru na dozu

Četiri pitanja primjenjiva su na gotovo svaku krivulju metilenskog modrila koju ćete susresti. Koji je mjereni ishod na okomitoj osi i bi li njegov preokret iscrtao U ili J. Koju koncentraciju vodoravna os zapravo prikazuje: nominalnu koncentraciju u kupki, koncentraciju u homogenatu, plazmi, procijenjenu koncentraciju u mozgu ili primijenjenu sistemsku dozu. Koji su model i vremenski raspored doveli do rezultata: homogenat, stanična kultura s uključenim ili isključenim svjetlom, životinje kojima je doza dana prije ili poslije učenja i vrijeme ispitivanja. I što je bila kontrola: fiziološka otopina, plavo prehrambeno bojilo, nosač te podupiru li statističke analize rada svaku tvrdnju o usporedbi parova ili samo ukupni oblik. Rad koji odgovara na sva četiri pitanja vrijedan je vašeg vremena. Onaj koji navodi vrhunac bez tih odgovora dao vam je broj bez adrese.