Metilensko modrilo i Bartonella: laboratorijski nalazi i ograničenja kliničkih dokaza

Posuda s kulturom i pacijent dijele riječ, infekcija, ali ne i isti pojam. U posudi je infekcija broj kolonija na agaru. U pacijentu su to bakterije unutar stanica i krvnih žila, lijekovi koji prolaze kroz krv i tkiva te imunološki sustav koji obavlja dio posla. Pomiješaju li se ta dva pojma, upečatljiv laboratorijski broj počinje izgledati kao liječenje. Razdvoje li se, isti broj postaje ono što jest: razlog za sljedeći eksperiment.

Upravo je to razdvajanje svrha ovog pregleda metilenskog modrila i bakterija roda Bartonella. Dva laboratorijska istraživanja iste istraživačke skupine ispitivala su metilensko modrilo protiv bakterije Bartonella henselae u stanjima bez rasta. Oba su zabilježila snažnu aktivnost u staklenim i plastičnim posudama. Nijedno nije provedeno na ljudima.

Zašto istraživači ispituju stacionarnu fazu

Većina ispitivanja antibiotika koristi stanice koje rastu. Taj model propušta zahtjevniji slučaj: stanice koje su se prestale dijeliti i podnose lijekove koji ubijaju njihove srodne stanice u rastu.

Bartonella može opstati u tijelu, uključujući unutar eritrocita i endotelnih stanica. Zato je skupina istražila koji odobreni lijekovi mogu ubiti B. henselae nakon ulaska u stacionarnu fazu. Niska minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) za stanice u rastu nije predviđala ubijanje stanica u stacionarnoj fazi. Rifampicin je imao vrlo nizak MIC, ali je slabo ubijao stanice u stacionarnoj fazi, dok su ih spojevi s višim vrijednostima MIC-a dobro ubijali. Čitatelji koji žele opću metodu za čitanje ovakvih radova pronaći će je u vodiču za čitanje istraživanja metilenskog modrila.

Prvo probirno ispitivanje: Li i suradnici, 2019

Probirno ispitivanje stacionarne faze iz 2019. u časopisu Antibiotics koristilo je jedan soj, B. henselae JK53, uzgojen u Schneiderovu mediju s 10 posto fetalnog goveđeg seruma pri 37 C i 5 posto CO2. Jednodnevne kulture uglavnom su sadržavale raspršene stanice koje se dijele. Petodnevne kulture, s približno 10 na 8. potenciju jedinica koje tvore kolonije po mL, smatrane su kulturama u stacionarnoj fazi i sadržavale su vidljive agregate.

Ispitivanje je koristilo SYBR Green I s propidijevim jodidom, uz kalibraciju na mješavinama živih stanica i stanica ubijenih izopropanolom. Budući da je metilensko modrilo snažno obojeno, pozitivni nalazi potvrđeni su mikroskopijom, a zatim brojanjem kolonija na krvnom agaru, što je stroži krajnji pokazatelj.

Među 1,581 odobrenih lijekova pri 50 mikromola, metilensko modrilo ostavilo je 16 posto živih stanica prema očitanju čitača mikrotitarskih ploča i 25 posto prema mikroskopiji. Daptomicin je ostvario rezultat od 21 posto, nekoliko azola od 22 do 27 posto, gentamicin 32 posto, eritromicin 66 posto, a ciprofloksacin 74 posto. Pirvinijev pamoat pokazao se snažnijim prema očitanju čitača, ali zbog vlastite fluorescencije nije ga bilo moguće procijeniti mikroskopijom.

Za B. henselae u rastu MIC metilenskog modrila iznosio je od 0.08 do 0.16 mikrograma po mL. Za petodnevne stanice u stacionarnoj fazi pri 5 mikrograma po mL broj kolonija nakon jednog dana izlaganja pao je na razinu bez detektabilnih kolonija, jednako kao kod daptomicina i pirvinijeva pamoata pri njihovim ispitivanim koncentracijama. Zasebno ispitivanje ubijanja tijekom vremena koristilo je 10 mikrograma po mL. To su laboratorijske razine izloženosti, a ne doze, i rad ih tako navodi. Citirana vršna koncentracija u ljudskoj plazmi od približno 3.9 mikrograma po mL pojavljuje se u radu samo kao pozadinski kontekst. Pregled farmakokinetike metilenskog modrila objašnjava zašto se koncentracija u plazmi ne može tumačiti kao koncentracija u tkivu.

U radu su izričito navedena dva ograničenja. Nije bilo modela biofilma ni ispitivanja kombinacija s metilenskim modrilom. Petodnevni agregati bili su nakupine u stacionarnoj tekućoj kulturi, a ne validirani eksperiment s biofilmom. Autori su pozvali na istraživanja na životinjama, ispitivanje kombinacija, istraživanja biofilma i ispitivanja drugih vrsta roda Bartonella.

Kombinacije i stanice dobivene iz biofilma: Zheng i suradnici, 2020

Nastavak istraživanja iz 2020. u časopisu BMC Microbiology zadržao je isti soj i medij, ali je prešao na šestodnevne stacionarne kulture i dodao dvije stvari koje su nedostajale prvom radu: kombinacije dvaju lijekova i model stanica dobivenih iz biofilma.

Pri ispitivanju pojedinačnih lijekova u jednakoj koncentraciji od 5 mikrograma po mL tijekom 24 sata, nakon metilenskog modrila preostalo je 3.2 puta 10 na 4. potenciju jedinica koje tvore kolonije po mL, u usporedbi s kontrolom od približno 2.8 puta 10 na 10. potenciju. Ciprofloksacin, gentamicin i nitrofurantoin ostavili su manje kolonija u istom trenutku. To se razlikuje od rezultata iz 2019., kada pri istoj nominalnoj koncentraciji nakon jednog dana nije bilo detektabilnih kolonija. Starost kulture, gustoća i postupanje razlikovali su se, pa je ubijanje bilo ponovljivo po smjeru učinka, ali ne i jednako po opsegu. Ta promjena između ponavljanja jedan je od razloga zašto standardne provjere sigurnosti i interakcija razmatraju laboratorijsku potentnost odvojeno od kliničkog učinka.

Probirno ispitivanje kombinacija najcitiraniji je dio. Svaka je komponenta bila na fiksnoj koncentraciji od 5 mikrograma po mL. I azitromicin s metilenskim modrilom i rifampicin s metilenskim modrilom nakon 24 sata dali su rezultat bez detektabilnih kolonija stacionarne faze, kao i obje kombinacije s ciprofloksacinom. Samo su te četiri kombinacije među 25 ispitanih parova dale takav rezultat. Nije provedena formalna analiza sinergije, pa je ispravan izraz aktivna kombinacija u tim uvjetima, a ne dokazana sinergija.

Eksperiment s biofilmom ispitivao je stanice izdvojene iz mladog razorenog biofilma, a ne prodiranje u netaknuti zreli biofilm. Kulture su uzgajane pet dana, razrijeđene u pločama s jažicama i uzgajane još pet dana, potvrđene bojenjem kristalnim violetom, a zatim sastrugane prije izlaganja lijekovima. Pri 5 mikrograma po mL, uz samo metilensko modrilo broj je do 6. dana pao na 2.3 puta 10 na 2. potenciju, što ga je svrstalo među najbolje pojedinačne tvari, ali rezultat nije bio nula. Obje kombinacije s metilenskim modrilom dosegnule su nulu do 6. dana, kao i obje kombinacije s ciprofloksacinom.

Autori su istaknuli ista ograničenja koja bi uočio pažljiv čitatelj: mladi sastrugani biofilm umjesto starog netaknutog biofilma, jedna praktično odabrana koncentracija za sve lijekove umjesto realistične vršne koncentracije za svaki lijek, samo odabrani parovi s azitromicinom ili rifampicinom, jedan soj, bez životinja i bez pacijenata. Kasnija istraživanja s trima lijekovima bila su predložena, ali rezultati nisu prikazani.

Usporedba ustroja istraživanja

Tablica sažeto prikazuje poantu ovog članka. Sve lijevo od posljednjeg stupca odnosi se na rad s kulturama. Nijedan nalaz iz tih dvaju radova ne pripada posljednjem stupcu.

Bartonella nije Borrelia

Oba rada spominju Borrelia burgdorferi, spirohetu koja uzrokuje lajmsku bolest, jer je ispitivanje s bojilom proizašlo iz ranijih istraživanja stacionarne faze bakterije Borrelia u istom laboratoriju, u kojima su metilensko modrilo i daptomicin također pokazali aktivnost. Ta je povijest koristan kontekst i čest izvor pogrešaka.

Nijedan eksperiment u tim radovima o bakteriji Bartonella ne ispituje bakterije Borrelia i Bartonella usporedno. Organizmi se razlikuju, mediji se razlikuju, koncentracije se razlikuju, a pretpostavljeni učinak metilenskog modrila na membranu bakterije Bartonella naveden je kao nagađanje koje zahtijeva dodatna istraživanja. Rezultate ne treba prenositi s jedne vrste na drugu, a nijedan rad ne podupire široke tvrdnje o parazitima. Usporedba perzistentnih stanica bakterija Borrelia i Bartonella upravo zato drži ta dva područja literature odvojenima.

Zašto se rezultati kultura ne mogu pretvoriti u protokol

Razumljiv je interes za pretraživanje protokola primjene metilenskog modrila za bakteriju Bartonella. Upravo su ovi radovi razlog zašto bi taj izraz trebalo smatrati znakom upozorenja, a ne popisom za kupnju.

Prvo, 5 mikrograma po mL u jažici nije recept za liječenje. Uz tu vrijednost nisu vezani podaci o apsorpciji, distribuciji, vezanju za proteine, prodiranju u stanice ni podnošljivosti. Autori su je odabrali kao grubi prosjek vršnih koncentracija antibiotika i naveli da bi buduća istraživanja trebala koristiti realističnu koncentraciju za svaki pojedini lijek.

Drugo, nula kolonija znači da u tim uvjetima nasađivanja nema kolonija, a ne da je tkivo sterilno. Perzistentne stanice, unutarstanične bakterije i ograničenja uzorkovanja ostaju izvan onoga što pokazuje agar-ploča.

Treće, kombinacije koje steriliziraju jažicu u tijelu mogu biti neuspješne ili štetne. Azitromicin s metilenskim modrilom i rifampicin s metilenskim modrilom laboratorijski su parovi pri laboratorijskim razinama izloženosti. Bez farmakokinetičkih istraživanja na životinjama i kontroliranih podataka iz istraživanja na ljudima nisu utvrđeni doza, trajanje ni omjer koristi i rizika. Svatko tko razmatra mogućnosti trebao bi o njima razgovarati s liječnikom i proučiti kada primjena metilenskog modrila zahtijeva medicinski nadzor prije donošenja bilo kakvog zaključka iz podataka dobivenih u posudama.

Ovi radovi podupiru samo ovaj uski zaključak: metilensko modrilo ima ponovljivu aktivnost protiv B. henselae JK53 koja ne raste in vitro, uključujući laboratorijske kombinacije dvaju lijekova, pri čemu najsnažniji rezultati za kombinacije i stanice dobivene iz biofilma potječu iz istraživanja iz 2020. Sve ostalo, uključujući pitanje je li ta aktivnost važna za bartonelozu u ljudi, ostaje neispitano.