EMB agar nasuprot MacConkey agaru: odabir i tumačenje podloga

Student zasijava isti uzorak vode na dvije ploče. Na jednoj se pojavljuju tamne kolonije sa zelenim metalnim sjajem. Na drugoj se pojavljuju jarko ružičaste kolonije s mutnim haloom. Obje su ploče inokulirane iz iste epruvete, inkubirane jedna uz drugu i očitane u isto vrijeme. Student pita koja je ploča ispravna.

Obje su ploče ispravne. Odgovaraju na različita pitanja. Zabuna nastaje kada se te dvije podloge smatraju međusobno zamjenjivim probirnim podlogama za crijevne bakterije. Imaju zajedničku svrhu, a to je selekcija Gram-negativnih enteričnih organizama i razlikovanje fermentatora laktoze od nefermentatora, ali tu svrhu ostvaruju različitom kemijom i različitom vizualnom logikom. Kada razumijete ta dva temeljna koncepta, odabir ploče i očitavanje kolonija postaju rutinski.

Kratak odgovor

EMB agar koristi dva bojila, eozin Y i metilensko plavo, koja imaju dvostruku ulogu: suzbijaju rast Gram-pozitivnih organizama i talože se oko snažnih proizvođača kiseline, stvarajući tamne kolonije, klasično sa zelenim metalnim sjajem kod Escherichia coli. MacConkey agar razdvaja te funkcije: žučne soli i kristal violet suzbijaju Gram-pozitivne organizme, laktoza omogućuje fermentaciju, a neutralno crveno pokazuje stvaranje kiseline kao ružičaste ili crvene kolonije. Ako je zadatak upečatljiva presumptivna demonstracija E. coli, EMB ima jasnu vrijednost. Ako je zadatak jasno razlikovanje ružičastih fermentatora laktoze od bezbojnih nefermentatora, osobito u postupcima s uzorcima stolice ili urina, MacConkey je obično jednostavniji za očitavanje. Nijedna ploča ne identificira organizam samo prema boji.

EMB: bojila koja istodobno selektiraju i signaliziraju

Koncept EMB-a objedinjuje selekciju i indikaciju u istim molekulama. ASM protokol za agar s eozinom i metilenskim plavilom opisuje EMB kao selektivnu i diferencijalnu podlogu, pri čemu par bojila inhibira mnoge Gram-pozitivne organizme, dok fermentacija laktoze potiče vezanje i taloženje bojila. Standardna Levineova formulacija sadrži pepton, laktozu, fosfat, eozin Y, metilensko plavo i agar, kako je navedeno u FDA BAM metodi za Levine EMB agar. Imajte na umu da su starije formulacije EMB-a ponekad uz laktozu sadržavale i saharozu, dok Levine EMB sadrži laktozu bez saharoze, stoga zabilježite koju formulaciju vaš laboratorij koristi.

Očitavanje EMB-a znači očitavanje ponašanja bojila. Intenzivna fermentacija laktoze stvara dovoljno kiseline da potakne obilno taloženje bojila, zbog čega E. coli dobiva tamnoplavo-crna središta i, u klasičnom slučaju, zeleni metalni sjaj u reflektiranoj svjetlosti. Slabiji fermentatori poput Enterobacter i Klebsiella obično rastu kao ružičaste do ljubičaste mukoidne kolonije bez tog sjaja. Nefermentatori poput Salmonella, Shigella i Proteus uglavnom rastu kao bezbojne ili prozirne kolonije jer ne stvaraju nagli porast kiseline koji uzrokuje taloženje bojila. Gram-pozitivni organizmi obično su suzbijeni, iako je stupanj suzbijanja promjenjiv te ovisi o soju i proizvodu. Potpuna kemija pripreme bojila, uključujući razlog zbog kojeg se metilensko plavo uopće ponaša kao kationsko bojilo, pripada zasebnoj raspravi o formulacijama bojila, a opći kontekst mikroskopije nalazi se u atlasu metoda bojenja. Ovaj se članak zadržava na odabiru i očitavanju podloga.

Gornja je slika ilustrativna. Prikazuje očekivanu vizualnu logiku: tamne kolonije sa sjajem, ružičaste mukoidne tipove i blijede tipove na EMB-u, nasuprot ružičastim i blijedim tipovima na MacConkey agaru. Koristite je za učenje obrasca, a zatim svako očitanje potvrdite usporedbom s fotografiranim kontrolama i uputom proizvoda za točnu podlogu koju koristite.

MacConkey: odvojene funkcije, jednostavnije vizualno pravilo

Koncept MacConkey agara svaku funkciju dodjeljuje zasebnom sastojku. ASM protokol za MacConkey agar koristi isti okvir selektivne i diferencijalne podloge, a FDA BAM metoda za MacConkey agar navodi ključne sastojke: peptone, laktozu, žučne soli, sol, neutralno crveno, kristal violet i agar. Žučne soli zajedno s kristal violetom selektiraju protiv Gram-pozitivnih organizama. Laktoza služi kao supstrat za fermentaciju. Neutralno crveno djeluje kao indikator pH-a, prelazeći u ružičastu do crvenu boju ondje gdje nastaje kiselina, ponekad uz istaloženu žuč oko snažnih fermentatora.

Pravilo očitavanja namjerno je jednostavno: ružičasto znači fermentator laktoze, a bezbojno ili blijedo znači nefermentator. E. coli izgleda ružičasto do crveno, često uz halo istaložene žuči. Klebsiella i Enterobacter izgledaju ružičasto i često mukoidno zbog svojih kapsula. Salmonella, Shigella, Proteus i mnogi drugi Gram-negativni štapići izgledaju bezbojno. Dodatna prednost važna je u nastavnim laboratorijima: žučne soli općenito smanjuju rojenje bakterija Proteus, pa je na MacConkey agaru lakše dobiti izolirane kolonije nego na neselektivnim podlogama, iako suzbijanje nije potpuno, a postoje i alternative bez soli kada je kontrola rojenja prioritet.

Molekularni razlog takvog ponašanja bojila povezan je s nabojem i strukturom. Metilensko plavo kationsko je fenotiazinsko bojilo čija struktura i svojstva objašnjavaju afinitet prema kiselim površinama bakterija, isti onaj afinitet koji djeluje kada se taloži u kiselim zonama na EMB-u.

Usporedba na prvi pogled

| Značajka | EMB agar | MacConkey agar |

| --- | --- | --- |

| Selektivni sustav | Eozin Y plus metilensko plavo | Žučne soli plus kristal violet |

| Diferencijalni supstrat | Laktoza (Levine nema saharozu) | Laktoza |

| Indikator | Samo taloženje bojila (tamne kolonije, zeleni sjaj) | Neutralno crveno (ružičaste do crvene kolonije koje stvaraju kiselinu) |

| Snažan signal E. coli | Tamnoplavo-crna kolonija, često metalno zeleni sjaj | Ružičasta do crvena kolonija, često uz talog žuči |

| Klebsiella i Enterobacter | Ružičaste do ljubičaste, mukoidne, obično bez sjaja | Ružičaste do crvene, često mukoidne |

| Salmonella, Shigella, Proteus | Obično bezbojne ili prozirne | Obično bezbojne ili blijede |

| Gram-pozitivni organizmi | Obično suzbijeni | Obično suzbijeni u formulacijama s kristal violetom |

| Najveća nastavna vrijednost | Jasno prikazuje snažnu nasuprot slaboj fermentaciji | Najjednostavnije razlikovanje fermentatora od nefermentatora |

Tablicu čitajte kao postupak odlučivanja. Kada vježba zahtijeva da studenti vide gradijent jačine fermentacije s jednom izrazitom krajnjom reakcijom, EMB to pokazuje. Kada vježba zahtijeva brzo binarno razvrstavanje prije biokemijske potvrde, MacConkey to omogućuje.

Koja podloga za koji uzorak

Za vježbe s vodom usmjerene na presumptivno prepoznavanje fekalnih koliforma ili E. coli, EMB je privlačan jer je sjaj vizualno prepoznatljiv. MacConkey također podržava rast enteričnih Gram-negativnih organizama i povijesno se koristio u ispitivanju vode, ali nijedna ploča ne zamjenjuje propisanu regulatornu metodu za vodu, koja ovisno o testu može zahtijevati podloge poput modificiranog mTEC-a ili MI-ja. Provjerite metodu koju je vaš laboratorij obvezan slijediti.

Za razdvajanje fermentatora od nefermentatora u uzorcima sličnim stolici, MacConkey je općenito korisniji od te dvije podloge. Praktičan rad sa stolicom za Salmonella ili Shigella obično uključuje dodatne, selektivnije enterične podloge kao što su XLD ili Hektoen enteric, umjesto oslanjanja samo na MacConkey.

Za nastavne uzorke slične urinu koji oponašaju klinički tijek rada, kombinirajte MacConkey s krvnim agarom. MacConkey omogućuje početno razvrstavanje Gram-negativnih organizama, dok krvni agar omogućuje rast organizama koje MacConkey suzbija. Ta je kombinacija standardna u kliničkim opisima postavljanja urinokulture.

Za poučavanje samog koncepta koristite obje podloge. EMB pokazuje da je intenzitet fermentacije važan i da jedna molekula može imati dvije uloge. MacConkey pokazuje modularni dizajn: selektor, supstrat i indikator odvojeni su jedan od drugoga. Studenti koji usporedno zasiju poznatu E. coli, poznatu Klebsiella aerogenes i poznatu Salmonella na obje podloge rijetko ponovno zamijene te dvije logike.

Zamke pri očitavanju koje se ponavljaju svakog semestra

Najčešća je pogreška identifikacija samo prema boji. Ružičasta kolonija na MacConkey agaru može biti E. coli, Klebsiella, Enterobacter ili neki drugi fermentator. Bezbojna kolonija može biti Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ili neki drugi nefermentator. Boja je probirni fenotip koji usmjerava daljnje potvrdne postupke kao što su bojenje po Gramu, oksidaza, biokemijski paneli ili instrumentalna identifikacija, a nije naziv vrste.

Druga je pogreška pridavanje prevelike važnosti izostanku sjaja. Neke stvarne kolonije E. coli, osobito izolirane, stvaraju malo ili nimalo metalnog sjaja na EMB-u. Izostanak sjaja ne isključuje E. coli, a njegova prisutnost je ne dokazuje. Sjaj tretirajte kao presumptivni pokazatelj.

Treća je pogreška uspoređivanje ploča različite starosti. Odgođeni fermentatori laktoze mogu nakon produljene inkubacije postati ružičasti na MacConkey agaru, čime se zamagljuje jasna podjela na fermentatore i nefermentatore. Očitajte u vremenu koje je odredio laboratorij i uz rezultat zabilježite trajanje inkubacije.

Četvrta je pogreška tumačenje miješanog rasta kao jednog organizma. Ružičasta kolonija pokraj bezbojne kolonije predstavlja dva fenotipa, a ne neki međutip. Odaberite dobro izolirane kolonije i svaki morfotip obrađujte zasebno. Mukoidna tekstura stvara sličnu zamku: i Klebsiella i Enterobacter mogu izgledati mukoidno, pa sama kapsula nikada ne određuje naziv. Organizam koji se nekada podučavao kao Enterobacter aerogenes sada je klasificiran kao Klebsiella aerogenes, što objašnjava zašto se starije tablice i novije oznake naizgled ne slažu.

Kontrole i završno pravilo

U svakoj sesiji koristite fotografirane ili svježe kontrole: E. coli za reakciju snažnog fermentatora, Klebsiella aerogenes za mukoidnu fermentaciju bez klasičnog sjaja, soj Salmonella za bezbojnu reakciju nefermentatora i Staphylococcus aureus za potvrdu suzbijanja Gram-pozitivnih organizama na vašem točnom proizvodu. Brojeve sojeva i kriterije prihvatljivosti uskladite s uputom proizvođača jer se selektivnost mijenja ovisno o sadržaju žuči, kristal violeta i bojila.

Zapamtite jednu rečenicu pri radu. EMB koristi bojila koja istodobno selektiraju i signaliziraju, čime dobivate upečatljiv signal E. coli uz cijenu suptilnijeg očitavanja. MacConkey razdvaja selekciju od signaliziranja, čime dobivate jednostavno razlikovanje ružičastog od blijedog uz cijenu manje detalja o fermentaciji. Odaberite podlogu čiji koncept odgovara pitanju, potvrdite boju odgovarajućim testovima i dvije ploče prestaju konkurirati jedna drugoj te počinju djelovati zajedno.