ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ અને રેટિક્યુલોસાઇટ રંગન: એક અલગ રંગક અને જીવંત કોષોની પદ્ધતિ

એક વિદ્યાર્થી રેટિક્યુલોસાઇટની ગણતરીની તૈયારી કરે છે, મિથિલીન બ્લૂ મંગાવે છે, તેને રક્ત સાથે મિશ્રિત કરે છે અને લગભગ કશું જ દેખાતું નથી. તેનો સહાધ્યાયી ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂનું લેબલ ધરાવતી બોટલ વાપરે છે અને કેટલાક લાલ રક્તકોષોની અંદર સ્પષ્ટ વાદળી તંતુઓ જુએ છે. પહેલો વિદ્યાર્થી માને છે કે બીજી બોટલનો રંગક વધુ તાજો અથવા વધુ સાંદ્ર હશે. બંનેમાંથી એકેય વાત સાચી નથી. તેમાં એક અલગ અણુ છે.

આ ક્ષેત્રની મોટાભાગની ગૂંચવણ પાછળ આ જ ખ્યાલગત ભૂલ છે. નામ પરથી એવું લાગે છે કે ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ એ મિથિલીન બ્લૂની સુધારેલી બેચ છે. રસાયણશાસ્ત્ર કંઈક જુદું કહે છે. ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ N એ એક અલગ ફીનોથાયાઝિન રંગક છે, જેનો પોતાનો કલર ઇન્ડેક્સ નંબર, પોતાનું અવેજી સમૂહોનું બંધારણ અને રુધિરવિજ્ઞાનમાં પોતાની પ્રમાણિત ભૂમિકા છે. એકવાર આ તફાવત સ્પષ્ટ થઈ જાય, પછી પદ્ધતિના બાકીના મુદ્દા — રંગન વખતે કોષો જીવંત કેમ હોવા જોઈએ, કયા કોષને રેટિક્યુલોસાઇટ ગણવો, હાઇન્ઝ બોડીનું સ્થાન શું છે અને બ્રિલિયન્ટ ક્રેસિલ બ્લૂ ક્યારે ઉપયોગમાં આવે છે — સરળતાથી સમજાય છે.

ટૂંકો જવાબ

રુધિરવિજ્ઞાનમાં વપરાતો અભિકર્મક ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ N સામાન્ય રીતે ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂના PubChem રેકોર્ડમાં બેઝિક બ્લૂ 24 તરીકે ઓળખાય છે, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, સૂત્ર C18H22ClN3S. સામાન્ય મિથિલીન બ્લૂ તેના PubChem રેકોર્ડમાં મિથિલથાયોનિનિયમ ક્લોરાઇડ, બેઝિક બ્લૂ 9 તરીકે ઓળખાય છે, C.I. 52015, CAS 61-73-4, સૂત્ર C16H18ClN3S. બંધારણની દૃષ્ટિએ, ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂમાં વલય પર બે મિથિલ સમૂહો અને એથિલએમિનો પાર્શ્વશૃંખલાઓ હોય છે, જ્યારે મિથિલીન બ્લૂમાં ડાઇમિથિલએમિનો સમૂહો હોય છે. આ તફાવત રંગનના વર્તનને બદલે છે. રુધિરવિજ્ઞાનનાં પાઠ્યપુસ્તકો સામાન્ય મિથિલીન બ્લૂને રેટિક્યુલોસાઇટ માટે પ્રમાણમાં નબળો રંગક અને ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂને વધુ ઘેરું અને વધુ સમાન રંગન આપતો રંગક કહે છે; આ તુલનાનો સાર ScienceDirectના ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ વિષયમાં આપવામાં આવ્યો છે.

હા, ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ એક સુપ્રાવાઇટલ રંગક છે. સુપ્રાવાઇટલ રંગન એટલે શરીરમાંથી કાઢ્યા પછી અને ફિક્સેશન પહેલાં જીવંત કોષોનું રંગન કરવું, જેમ સુપ્રાવાઇટલ રંગનના સિદ્ધાંતોની NCBI સમીક્ષામાં વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યું છે. ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ અને બ્રિલિયન્ટ ક્રેસિલ બ્લૂ બંને આ શ્રેણીમાં આવે છે, અને CLSIનું રેટિક્યુલોસાઇટ ધોરણ ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂને સ્પષ્ટપણે સુપ્રાવાઇટલ રંગક તરીકે આવરી લે છે. વિદ્યાર્થીઓ ક્યારેક આને ફિક્સ કરેલી ફિલ્મોના રોમાનોવ્સ્કી રંગન સાથે જોડી દે છે. અહીં એ સમજ લાગુ પડતી નથી. પહેલાં ફિક્સેશન કરશો તો પદ્ધતિ કામ કરવાનું બંધ કરી દેશે.

સમાન નામ ધરાવતા રંગકો વિશે જાણતા વાચકો માટે, મિથિલ બ્લૂ સામે મિથિલીન બ્લૂ ઋણાયનિક ટ્રાઇએરિલમિથેન રંગક અને ધનાયનિક ફીનોથાયાઝિન પરિવાર વચ્ચેની અલગ અને વધુ મોટી ગૂંચવણને સમજાવે છે. પ્રયોગશાળાના રંગનની ઝાંખી ફિક્સ કરેલી ફિલ્મોની પદ્ધતિઓ વચ્ચે સુપ્રાવાઇટલ કાર્યનું સ્થાન સમજાવે છે, અને રક્તકોષોની આકારવિજ્ઞાન માર્ગદર્શિકા દર્શાવે છે કે વ્યાપક વિભેદક ગણતરીમાં રેટિક્યુલોસાઇટનું મૂલ્યાંકન ક્યાં આવે છે.

કેટલોગ અંગે એક સાવચેતી: ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂનું અલગ ઝિંક ક્લોરાઇડ દ્વિક્ષાર સ્વરૂપ CAS 6586-05-6 હેઠળ મળે છે. તેથી પદ્ધતિના વિભાગમાં માત્ર સામાન્ય નામ નહીં, પણ ક્ષારનું સ્વરૂપ અને સપ્લાયરનું નામ પણ આપવું જોઈએ.

સુપ્રાવાઇટલ રંગન ખરેખર શું કરે છે

રેટિક્યુલોસાઇટ એક યુવાન લાલ રક્તકોષ છે, જેણે પોતાનું કેન્દ્રક ગુમાવ્યું હોય છે, પરંતુ તેમાં અવશેષ રાઇબોસોમલ RNA રહે છે. રંગન વગરની ભીની તૈયારીમાં આ RNA અદૃશ્ય હોય છે. સુપ્રાવાઇટલ રંગક જીવંત કોષમાં પ્રવેશે છે અને આ RNAને અવક્ષેપિત અથવા એકત્રિત કરીને વાદળી કણો અને તંતુઓ બનાવે છે; ઓઇલ ઇમર્શન હેઠળ દેખાતી આ સામગ્રી રેટિક્યુલોફિલામેન્ટસ સામગ્રી છે. તેથી આ જાળ રંગનથી બનેલી રચના છે, રંગની રાહ જોતું પહેલેથી બનેલું માળખું નથી. આથી જ પ્રોટોકોલનાં પરિવર્તનશીલ પરિબળો — રંગકની સાંદ્રતા, બફર, રક્ત અને રંગકનો ગુણોત્તર, તાપમાન અને સમય — રંગકના નામ જેટલાં જ મહત્ત્વનાં છે.

વ્યવહારમાં તેનો અર્થ છે કે કામગીરીનો ક્રમ કડક રીતે જાળવવો: પહેલાં રક્તજમાવરોધક સાથે રાખેલું રક્ત રંગક સાથે મિશ્રિત કરો, ઇન્ક્યુબેટ કરો, પછી ફિલ્મો બનાવો અને ફિક્સેશન તથા પ્રતિરંગન વગર તપાસો. રંગન પહેલાંનું ફિક્સેશન અથવા ઝાંખા તંતુઓને ઢાંકી દેતું પ્રતિરંગન, ગણતરી જેના પર આધારિત છે તે માહિતી નષ્ટ કરે છે.

ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ સાથે રેટિક્યુલોસાઇટ માટેનો વ્યવહારુ પ્રોટોકોલ

એક જ સર્વમાન્ય ફોર્મ્યુલેશન નથી, તેથી જે વપરાયું હોય તેની જાણ કરો. દસ્તાવેજીકૃત ત્રણ વિકલ્પો તેની વ્યાપકતા દર્શાવે છે.

પરંપરાગત બ્રેચર પ્રકારની પ્રક્રિયામાં પોટેશિયમ ઑક્સાલેટ સાથે આશરે 0.5 percent ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ વપરાય છે. તેને સારી રીતે મિશ્રિત કરેલા EDTA રક્ત સાથે સમાન આયતનમાં ભેળવીને ઓરડાના તાપમાને આશરે 10 થી 15 મિનિટ ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવે છે. હળવેથી ફરી મિશ્રિત કર્યા પછી પાતળી ફાચરાકાર ફિલ્મો તૈયાર કરાય છે, હવામાં સૂકવાય છે અને ફિક્સેશન વગર 100x ઓઇલ ઑબ્જેક્ટિવ હેઠળ તપાસાય છે. રેટિક્યુલોસાઇટની ગણતરી માટેની NCBI પ્રક્રિયા આ કાર્યપ્રવાહ અને તેની સાથે વપરાતી ગણતરીની ફ્રેમનું વર્ણન કરે છે.

ડેસી અને લૂઇસના વિકલ્પમાં સાઇટ્રેટ સેલાઇનમાં 1.0 percent ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ વપરાય છે. તેને રક્તના 2 થી 4 આયતન ભાગો સાથે મિશ્રિત કરીને ફિલ્મ બનાવતાં પહેલાં 37 C પર 15 થી 20 મિનિટ રાખવામાં આવે છે. CLSI H44 પ્રક્રિયાને સુસંગત બનાવવાના તાજેતરના અમલીકરણમાં pH 7.4 ધરાવતા ફૉસ્ફેટ બફર્ડ સેલાઇનમાં ઓછી સાંદ્રતાવાળું 0.1 percent દ્રાવણ વપરાયું હતું, જેમાં 20 C પર 10 મિનિટનું ઇન્ક્યુબેશન અને કોઈ ફિક્સેશન નહોતું, જેમ 2026ના NMB સુસંગતીકરણ અભ્યાસમાં જણાવાયું છે.

બધા વિકલ્પોમાં ગણતરીના નિયમો સમાન છે. કોઈ કોષમાં વાદળી રંગાયેલા ઓછામાં ઓછા બે અલગ કણો અથવા તંતુખંડો હોય ત્યારે તેને રેટિક્યુલોસાઇટ ગણો; આ નિયમ એકલા રંગકના થાપણને ગણતરીમાંથી બાકાત રાખે છે. નિયમિત કાર્યમાં ઓછામાં ઓછા 1,000 લાલ રક્તકોષો ગણો અને રેટિક્યુલોસાઇટનું પ્રમાણ ટકાવારીમાં જણાવો. ટકાવારી ઓછી હોય ત્યારે આંકડાશાસ્ત્ર વધુ કોષોની ગણતરી માંગે છે. CLSI H44 પદ્ધતિની સમીક્ષા નોંધે છે કે રેટિક્યુલોસાઇટનું પ્રમાણ લગભગ 1 percent હોય ત્યારે ગણતરીની ભિન્નતાને 5 percent સુધી લાવવા આશરે 4,400 કોષો ગણવા જરૂરી છે; આ માહિતી De Gruyter પરની CLSI H44 સમીક્ષામાં આપવામાં આવી છે. મિલર ઑક્યુલર ડિસ્ક મોટી ગણતરીને વ્યવહારુ બનાવે છે. રંગકને ગાળો અથવા તાજો તૈયાર કરો, કારણ કે અવક્ષેપ કોષની અંદરના દાણાદાર સમાવિષ્ટો જેવો દેખાય છે.

એ જ તૈયારીમાં હાઇન્ઝ બોડી

એ જ સુપ્રાવાઇટલ ફિલ્મમાં હાઇન્ઝ બોડી પણ દેખાઈ શકે છે; તે અવશેષ RNAને બદલે ઑક્સિડાઇઝ્ડ અને વિકૃત થયેલા હિમોગ્લોબિનના સમૂહો છે. ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂની તૈયારીઓમાં તે ગોળ રચનાઓ તરીકે દેખાય છે, ઘણી વાર એક જ અને કોષપટલની નજીક હોય છે, અને રેટિક્યુલોફિલામેન્ટસ સામગ્રી કરતાં હળવા વાદળી રંગે રંગાય છે. ફિક્સેશન અને પ્રતિરંગન દરમિયાન તે સારી રીતે જળવાતા નથી, તેથી ફિક્સ ન કરેલી ફિલ્મ તપાસો. તાજેતરના એક પ્રોટોકોલમાં 20 microliters EDTA રક્ત સાથે 20 microliters 1 percent ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ અને 15 મિનિટનું ઇન્ક્યુબેશન વાપરીને 250 લાલ રક્તકોષોમાં હાઇન્ઝ બોડી ધરાવતા કોષોનું પ્રમાણ માપવામાં આવ્યું હતું; આ પ્રક્રિયા તેનું વર્ણન કરતા PMC અભ્યાસમાં જણાવાઈ છે.

બે તફાવતો ખોટા અર્થઘટનને અટકાવે છે. પ્રથમ, મિથિલ વાયોલેટ અને ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ હાઇન્ઝ બોડીને ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ કરતાં વધુ ઘેરા રંગે રંગે છે, જેમ ScienceDirectના હાઇન્ઝ બોડી વિષયમાં નોંધાયું છે. રેટિક્યુલોસાઇટ અને હાઇન્ઝ બોડીનું એકસાથે મૂલ્યાંકન કરતી વખતે ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ અનુકૂળ પસંદગી છે, પરંતુ ખાસ હાઇન્ઝ બોડી માટેનો સૌથી શક્તિશાળી રંગક નથી. બીજું, આલ્ફા થેલેસેમિયા ટ્રેઇટમાં HbH સમાવિષ્ટો સુપ્રાવાઇટલ રંગન પછી આખા કોષમાં અનેક સૂક્ષ્મ ટપકાં ઉત્પન્ન કરે છે, જ્યારે પરંપરાગત હાઇન્ઝ બોડી સંખ્યામાં ઓછી, કદમાં મોટી અને ઘણી વાર કોષપટલ સાથે સંકળાયેલી હોય છે. રંગકનું થાપણ ત્રીજી સમાન દેખાતી વસ્તુ છે: તે કોષોના ફોકલ સમતલની બહાર હોય છે અને અલગ દૃશ્યક્ષેત્રોમાં બદલાય છે.

બ્રિલિયન્ટ ક્રેસિલ બ્લૂ સામે ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ

બંને રંગકો રેટિક્યુલોસાઇટ માટેના સુપ્રાવાઇટલ રંગકો છે, પરંતુ પ્રમાણભૂતીકરણ તેમાંના એકને પ્રાધાન્ય આપે છે. ઇન્ટરનેશનલ કાઉન્સિલ ફોર સ્ટાન્ડર્ડાઇઝેશન ઇન હીમેટોલોજી સાથે સંયુક્ત રીતે વિકસાવેલી અને CLSI H44 ધોરણના પૃષ્ઠ પર સૂચિબદ્ધ CLSI H44-A2 રેટિક્યુલોસાઇટ પદ્ધતિ, EDTA રક્તનું ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂથી રંગન હસ્તચાલિત તુલનાત્મક પદ્ધતિ તરીકે નિર્ધારિત કરે છે. પરંપરાગત રુધિરવિજ્ઞાનનું શિક્ષણ પણ દેખાવ અંગે આ વાત સાથે સહમત છે: ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ તંતુઓનું વધુ ઘેરું અને વધુ સમાન રંગન આપે છે, જ્યારે બ્રિલિયન્ટ ક્રેસિલ બ્લૂમાં બેચ અને નમૂનાઓ વચ્ચે વધુ ભિન્નતા જોવા મળે છે.

આ દરજ્જા સાથે તેની મર્યાદા પણ સમજવી જરૂરી છે. ICSHની વિશ્લેષક મૂલ્યાંકન માર્ગદર્શિકા હસ્તચાલિત ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ સૂક્ષ્મદર્શિકીને સંદર્ભ તુલનાની રીત તરીકે સ્વીકારે છે, પરંતુ તેને નિરીક્ષકના નિર્ણય પર આધારિત અને પ્રમાણમાં ઓછી ચોકસાઈવાળી કહે છે; જ્યાં ઉપલબ્ધ હોય ત્યાં ફ્લો સાયટોમેટ્રિક સંદર્ભ પ્રક્રિયાઓને પ્રાધાન્ય અપાય છે. 2022માં 100 નમૂનાઓની તુલનામાં, ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ કરતાં બ્રિલિયન્ટ ક્રેસિલ બ્લૂ સાથે ઉપયોગમાં લેવાયેલા વિશ્લેષકની સરખામણીમાં ઓછો વ્યવસ્થિત તફાવત જોવા મળ્યો હતો, જેમ રંગન પદ્ધતિઓની PMC તુલનામાં જણાવાયું છે. વિદ્યાર્થીઓ માટે પુરાવા આધારિત સાર આ છે: ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂને પ્રમાણિત હસ્તચાલિત તુલનાત્મક માપદંડ તરીકે વાપરો, કોઈપણ સ્થાનિક બ્રિલિયન્ટ ક્રેસિલ બ્લૂ પદ્ધતિને તેની સામે અથવા સ્વચાલિત પદ્ધતિ સામે ચકાસો, અને બંને કિસ્સામાં હસ્તચાલિત સૂક્ષ્મદર્શિકીથી પરિણામોમાં વધુ ફેલાવાની અપેક્ષા રાખો. પ્રમાણભૂતીકરણના જૂના સાહિત્યમાં પણ શુદ્ધ કરેલા Azure Bને રાસાયણિક રીતે વધુ શુદ્ધ વિકલ્પ તરીકે સમર્થન આપવામાં આવ્યું હતું, કારણ કે વ્યાપારી રંગકોની બેચમાં ભિન્નતા હતી; આ વાત Azure B અંગેના માર્શલ અભ્યાસમાં જણાવાઈ છે. આથી સમજાય છે કે પદ્ધતિઓની ચર્ચામાં અભિકર્મકનો ગ્રેડ હજુ પણ શા માટે ઉલ્લેખાય છે.

સામાન્ય ભૂલો ટાળવી

મોટાભાગની નિષ્ફળ તૈયારીઓ માટે ચાર ભૂલો જવાબદાર છે. ન્યૂ મિથિલીન બ્લૂ Nને બદલે સામાન્ય મિથિલીન બ્લૂ મંગાવવાથી રંગન નબળું થાય છે; તેનું કારણ રસાયણશાસ્ત્ર છે, તકનીક નહીં. નિરીક્ષણ પહેલાં ફિક્સેશન અથવા પ્રતિરંગન કરવાથી સુપ્રાવાઇટલ સંકેત દૂર થાય છે. રંગકના અવક્ષેપને કણો તરીકે ગણવાથી પરિણામ વધારે આવે છે, જેને બે કણોનો નિયમ અને ગાળેલો રંગક અટકાવે છે. રેટિક્યુલોસાઇટની ટકાવારી ઓછી હોય ત્યારે ખૂબ ઓછા કોષો ગણવાથી સંખ્યા ચોક્કસ દેખાય છે, પરંતુ તેની વિશ્વાસ મર્યાદાઓ પહોળી હોય છે. દરેક ભૂલની ઓળખ સમાન છે: અભિકર્મકના તબક્કાએ જે પરિણામ નક્કી કર્યું હોય તેના માટે સૂક્ષ્મદર્શક નિરીક્ષક સૂક્ષ્મદર્શકને દોષ આપે છે.