મેથિલીન બ્લૂથી સરળ રંગાઈ સામે ગ્રામ રંગાઈ: દરેક પદ્ધતિ શું સાબિત કરી શકે

એક વિદ્યાર્થી E. coliનું લેબલ ધરાવતા કલ્ચરમાંથી સ્મિયર તૈયાર કરે છે, તેને એક મિનિટ સુધી મેથિલીન બ્લૂથી સંપૂર્ણ ઢાંકે છે, ધોઈ કાઢે છે અને તેલ-નિમજ્જન લેન્સથી જુએ છે. દૃશ્યક્ષેત્રમાં વાદળી દંડાકાર કોષો દેખાય છે. પ્રયોગશાળાના અહેવાલમાં લખાય છે: "E. coli તરીકે ઓળખાયેલા ગ્રામ-નેગેટિવ દંડાકાર બેક્ટેરિયા." અવલોકન સાચું છે. પરંતુ તે સ્લાઇડ આ નિષ્કર્ષને સમર્થન આપતી નથી.

ભૂલ તકનીકી નહીં, પણ વૈચારિક છે. વિદ્યાર્થીએ સરળ રંગાઈને જાણે તે ભેદક પરીક્ષણ હોય તેમ ગણી છે. સરળ રંગાઈ અને ગ્રામ રંગાઈ જુદા પ્રશ્નોના જવાબ આપે છે, કારણ કે બંને રંગાઈના જુદા સિદ્ધાંતો પર આધારિત છે. એક પૂછે છે: કયો આકાર હાજર છે. બીજી પૂછે છે: પરીક્ષણની પરિસ્થિતિમાં કોષભિત્તિ કેવી રીતે વર્તે છે. બંનેને ગૂંચવો તો યોગ્ય રીતે રંગાયેલી સ્લાઇડ પરથી પણ આધારવિહોણો અહેવાલ તૈયાર થાય છે.

આ સરખામણી બંને પદ્ધતિઓને અલગ રાખે છે, દરેક પરિણામના આધારે તમે કયો દાવો કરી શકો તે દર્શાવે છે અને વિદ્યાર્થીઓના બે સૌથી સામાન્ય પ્રશ્નોના જવાબ આપે છે: શું ગ્રામ રંગાઈમાં મેથિલીન બ્લૂ વાપરી શકાય, અને E. coliની મેથિલીન બ્લૂ રંગાઈ ખરેખર શું દર્શાવે છે.

ટૂંકો જવાબ

મેથિલીન બ્લૂથી સરળ રંગાઈમાં રંગ ગ્રહણ કરી શકતા દરેક કોષને એકસરખો વાદળી રંગ મળે છે, તેથી તે આકારવિજ્ઞાન (દંડાકાર, ગોળાકાર, સર્પાકાર) અને ગોઠવણી (એકલ, જોડી, સાંકળ) દર્શાવે છે, પરંતુ ગ્રામ વર્ગ વિશે કશું જણાવતી નથી. ગ્રામ રંગાઈમાં આયોડિન, વિરંજનનું પગલું અને પ્રતિરંજક ઉમેરાય છે, તેથી બેક્ટેરિયાના કોષઆવરણો રંગને કેવી રીતે જાળવી રાખે છે તેના આધારે તેમને ગ્રામ-પોઝિટિવ (જાંબલી) અને ગ્રામ-નેગેટિવ (ગુલાબી અથવા લાલ)માં અલગ પાડે છે. મેથિલીન બ્લૂ પછી દેખાતા વાદળી દંડાકાર કોષોનો અર્થ છે કે "દંડાકાર કોષો હાજર છે." સંપૂર્ણ ગ્રામ પ્રક્રિયા પછી દેખાતા ગુલાબી દંડાકાર કોષોનો અર્થ છે કે "ગ્રામ-નેગેટિવ દંડાકાર કોષો હાજર છે." બીજું નિવેદન વધુ મજબૂત છે, કારણ કે તે પ્રક્રિયામાં એક વધારાનું પરીક્ષણ થયું છે.

આ લેખ જે એક-રંજક બેક્ટેરિયલ પદ્ધતિઓના વ્યાપક સમૂહનો ભાગ છે તે માટે સૂક્ષ્મદર્શકીય રંગાઈનો એટલસ જુઓ.

સરળ રંગાઈ: એક રંજક, એક પ્રશ્ન

મેથિલીન બ્લૂ એક ક્ષારીય (ધનાયનિક) રંજક છે. તેનો રંગીન આયન ધન વિદ્યુતભાર ધરાવે છે અને કોષમાં ન્યુક્લિક એસિડ તથા સપાટી પરના અમ્લીય સમૂહો સહિત ઋણભારિત રચનાઓ સાથે બંધાય છે, જેથી આછા પૃષ્ઠભૂમિ સામે કોષો વાદળી દેખાય છે. OpenStax તેના રંગાઈના પ્રકરણમાં આ સકારાત્મક રંગાઈનો સિદ્ધાંત સમજાવે છે. રંજકનો ધનાયન પોતે એક નાનો, સપાટ ફિનોથાયાઝિન આયન છે, જેની વિગતો મેથિલીન બ્લૂના રસાયણશાસ્ત્ર સંદર્ભમાં આપવામાં આવી છે; ક્લોરાઇડ પ્રતિઆયન રંગ આપતો નથી.

પ્રમાણભૂત શિક્ષણ પ્રોટોકોલ ઇરાદાપૂર્વક સરળ રાખવામાં આવે છે: પાતળો સ્મિયર બનાવો, હવામાં સુકવો, ગરમીથી સ્થિર કરો, લગભગ 1% જલીય મેથિલીન બ્લૂથી આશરે એક મિનિટ સુધી સંપૂર્ણ ઢાંકો, પાણીથી હળવેથી ધોવો, શોષક કાગળથી હળવેથી સુકવો અને તેલ-નિમજ્જનથી તપાસો. LibreTextsનો એક શિક્ષણ પ્રોટોકોલ બરાબર આ 1% અને એક મિનિટની રીત આપે છે, સાથે નોંધે છે કે કેટલીક પ્રયોગશાળાઓ સમય વધારે રાખે છે. કોઈ રંગબંધક નહીં, કોઈ વિરંજક નહીં, કોઈ બીજો રંજક નહીં. આ ગેરહાજરી જ મુખ્ય મુદ્દો છે. માત્ર એક રંજક હોય અને તેને પસંદગીપૂર્વક દૂર કરવામાં ન આવે, ત્યારે રંજક સાથે બંધાતો દરેક કોષ અંતે એકસરખો રંગ ધરાવે છે.

E. coliમાં અપેક્ષિત દૃશ્યક્ષેત્ર વાદળી દંડાકાર કોષો (બેસિલી)નું હોય છે, જે એકલા, જોડીમાં અથવા નાના સમૂહોમાં દેખાય છે. વાદળી રંગ રંજકમાંથી આવે છે. દંડાકાર આકાર જીવનો પોતાનો છે. પરંતુ આ સંયોજન જીવની ઓળખ કરતું નથી, કારણ કે ઘણી પ્રજાતિઓ દંડાકાર હોય છે અને ઘણા દંડાકાર કોષો સરળ રંગાઈમાં વાદળી રંગાય છે. ATCC તેની સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાન કલ્ચર માર્ગદર્શિકામાં આ માત્ર આકારવિજ્ઞાન સુધીની મર્યાદા સ્પષ્ટ કરે છે. યોગ્ય અહેવાલમાં લખાય છે: "વાદળી બેસિલી જોવા મળ્યા." આકાર અને ગોઠવણીથી આગળના કોઈપણ નિષ્કર્ષ માટે વધુ પુરાવા જોઈએ.

ગ્રામ રંગાઈ: ચાર અભિકારકો, વર્તનનું એક પરીક્ષણ

ગ્રામ રંગાઈ એક ભેદક રંગાઈ છે. તેમાં બધા કોષોને એક જ ક્રમની પ્રક્રિયામાંથી પસાર કરવામાં આવે છે અને કયા કોષો પ્રથમ રંજક જાળવી રાખે છે તથા કયા તેને ગુમાવે છે તે જોવામાં આવે છે. અમેરિકન સોસાયટી ફોર માઇક્રોબાયોલોજીના ગ્રામ રંગાઈ પ્રોટોકોલ પ્રમાણભૂત ચાર પગલાંનો ક્રમ નક્કી કરે છે: ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ (પ્રાથમિક રંજક), ગ્રામ આયોડિન (રંગબંધક), આલ્કોહોલ અથવા એસિટોન-આલ્કોહોલ (વિરંજક), પછી સેફ્રેનિન (પ્રતિરંજક).

પ્રમાણભૂત શિક્ષણ મોડેલ આ ભેદને કોષઆવરણની રચના દ્વારા સમજાવે છે. ગ્રામ-પોઝિટિવ કોષોની પેપ્ટિડોગ્લાયકેન ભિત્તિ જાડી હોય છે, જે આલ્કોહોલથી ધોવા દરમિયાન નિર્જલિત થાય છે અને ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ-આયોડિન સંકુલને જાળવી રાખે છે. ગ્રામ-નેગેટિવ કોષોમાં પેપ્ટિડોગ્લાયકેનનું પાતળું સ્તર અને લિપિડથી સમૃદ્ધ બાહ્ય પટલ હોય છે, જેને વિરંજક ખલેલ પહોંચાડે છે; તેથી સંકુલ ધોવાઈ જાય છે અને ત્યારબાદ કોષો સેફ્રેનિન ગ્રહણ કરે છે. NCBI Bookshelfની ગ્રામ રંગાઈ સમીક્ષા કોષભિત્તિની આ સમજૂતી આપે છે. નિષ્ણાતો ઉમેરે છે કે સંપૂર્ણ ભૌતિક-રાસાયણિક પ્રક્રિયા માત્ર ભિત્તિની જાડાઈ કરતાં વધુ જટિલ છે, પરંતુ પ્રયોગશાળામાં અર્થઘટન માટે વર્તનનો નિયમ લાગુ પડે છે: જાંબલી એટલે રંજક જળવાયો, ગુલાબી એટલે પ્રથમ રંજક ગુમાવ્યો અને પછી પ્રતિરંજકથી રંગાયો.

સમજાવટરૂપ પેનલો. પદ્ધતિઓની સરખામણી માટેનાં શૈલીબદ્ધ રેખાચિત્રો, કેમેરાથી લીધેલા માઇક્રોગ્રાફ નહીં. તર્ક સમજાવવા રંગોને સરળ બનાવ્યા છે: સરળ રંગાઈમાં એક રંગ, ગ્રામ વિરંજન પછી બે રંગ.

શું ગ્રામ રંગાઈમાં મેથિલીન બ્લૂ વાપરી શકાય

આ પ્રશ્નના બે અર્થ થાય છે અને બંનેના જવાબ અલગ છે.

પહેલો અર્થ: શું મેથિલીન બ્લૂથી એક વાર સંપૂર્ણ ઢાંકવું આખી ગ્રામ પ્રક્રિયાનું સ્થાન લઈ શકે. નહીં. આયોડિન, વિરંજક અને પ્રતિરંજક વિના કોઈ ભેદક પગલું થતું નથી, તેથી કોઈ ગ્રામ વર્ગનું પરીક્ષણ થતું નથી. માત્ર મેથિલીન બ્લૂ પછીનું વાદળી દૃશ્યક્ષેત્ર સરળ રંગાઈનું પરિણામ છે, ભલે તેની બોટલ ગ્રામ અભિકારકોની બાજુમાં રાખેલી હોય. તેને ગ્રામ પરિણામ તરીકે નોંધશો નહીં.

બીજો અર્થ: શું પગલું 4માં પ્રતિરંજક તરીકે મેથિલીન બ્લૂ સેફ્રેનિનનું સ્થાન લઈ શકે. કાર્યની દૃષ્ટિએ તે વિરંજિત કોષોને રંગ આપી શકે છે અને પાઠ્યપુસ્તકના એક અભ્યાસ મુજબ આવા ફેરફાર પછી ગ્રામ-પોઝિટિવ કોષો જાંબલી અને ગ્રામ-નેગેટિવ કોષો વાદળી દેખાવાની અપેક્ષા છે. આ તર્ક યોગ્ય છે, કારણ કે યોગ્ય રીતે વિરંજિત ગ્રામ-નેગેટિવ કોષો લગભગ રંગહીન હોય છે અને બીજો ધનાયનિક રંજક ગ્રહણ કરશે. પરંતુ આ પ્રમાણભૂત પ્રોટોકોલ નથી. ASM પ્રોટોકોલ સેફ્રેનિન નિર્દિષ્ટ કરે છે, અને કેટલીક આવૃત્તિઓમાં બેઝિક ફ્યુક્સિન જેવા માન્ય વિકલ્પો છે, મેથિલીન બ્લૂ નહીં. એક વ્યવહારુ મુશ્કેલી પણ છે: જાંબલી સામે વાદળીનો ભેદ પારખવો જાંબલી સામે ગુલાબી કરતાં મુશ્કેલ છે, ખાસ કરીને નવા શીખનારાઓ માટે અને ખાસ કરીને નબળો પ્રકાશ આપતા સૂક્ષ્મદર્શકના દીવા હેઠળ. અભ્યાસક્રમના કાર્યમાં અને કોઈપણ મહત્ત્વના પરિણામ માટે તમારા પ્રોટોકોલમાં જણાવેલો પ્રતિરંજક, સામાન્ય રીતે સેફ્રેનિન, વાપરો અને મેથિલીન બ્લૂ પ્રતિરંજકને સમકક્ષ પ્રમાણભૂત પદ્ધતિ નહીં, પણ નિદર્શન માટેની એક ભિન્ન આવૃત્તિ માનો.

મેથિલીન બ્લૂની અન્ય એક-રંજક વિકલ્પો સાથેની સરખામણી અંગેનો સંબંધિત પ્રશ્ન સરળ બેક્ટેરિયલ રંગાઈઓની સરખામણીમાં આવરી લેવાયો છે.

E. coliની મેથિલીન બ્લૂ રંગાઈ શું સાબિત કરે છે અને શું નથી કરતી

E. coli એક ગ્રામ-નેગેટિવ દંડાકાર બેક્ટેરિયમ છે, પરંતુ આ વાક્યમાં અનેક પદ્ધતિઓથી મળેલી હકીકતો જોડાયેલી છે: સૂક્ષ્મદર્શક તપાસથી આકારવિજ્ઞાન, ગ્રામ રંગાઈથી ગ્રામ પ્રતિક્રિયા અને કલ્ચર સાથે જૈવરાસાયણિક અથવા આણ્વિક પરીક્ષણથી ઓળખ. મેથિલીન બ્લૂ સ્મિયર માત્ર પ્રથમ ભાગમાં ફાળો આપે છે. તે સ્થાપિત કરે છે કે રંગાયેલા નમૂનામાં દંડાકાર કોષો હાજર છે અને તેમની ગોઠવણી કેવી છે. તે ગ્રામ પ્રતિક્રિયા સ્થાપિત કરતું નથી, કારણ કે વિરંજનનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું નથી. તે પ્રજાતિની ઓળખ કરતું નથી, કારણ કે આ વિભેદન ક્ષમતા પર ઘણી પ્રજાતિઓના દંડાકાર કોષો એકસરખા દેખાય છે.

અહીં અહેવાલો અનુમાન કરી શકાય તેવી રીતે ખોટા પડે છે. લેખક પૃષ્ઠભૂમિની જાણકારી ("આ કલ્ચર E. coliનું હોવાનું માનવામાં આવે છે અને E. coli ગ્રામ-નેગેટિવ છે")ને અવલોકનની પંક્તિમાં ભેળવી દે છે, જેથી સ્લાઇડ ખરેખર જે ધારી લેવામાં આવ્યું હતું તેની પુષ્ટિ કરતી હોય એવું લાગે છે. વધુ સ્પષ્ટ અહેવાલ આ સ્તરોને અલગ રાખે છે: "મેથિલીન બ્લૂથી સરળ રંગાઈ: વાદળી બેસિલી જોવા મળ્યા; માત્ર આકારવિજ્ઞાન, કોઈ ગ્રામ વર્ગનું પરીક્ષણ થયું નથી." પછી, જો નિયંત્રણો સાથે ગ્રામ રંગાઈ યોગ્ય રીતે કરવામાં આવી હોય તો: "ગ્રામ રંગાઈ: ગુલાબી દંડાકાર કોષો, ગ્રામ-નેગેટિવ સાથે સુસંગત." પ્રજાતિની ઓળખ પછીથી, ઓળખની કાર્યપ્રક્રિયામાંથી મળે છે, માત્ર રંગ પરથી નહીં.

અર્થઘટન માટે વ્યવહારુ માર્ગદર્શિકા

પ્રયોગશાળામાં આ નિર્ણયનો નિયમ વાપરો. જો બધા કોષો એક જ રંગના હોય અને પ્રોટોકોલમાં વિરંજક વિના એક જ રંજક વપરાયો હોય, તો તમે સરળ રંગાઈ કરી છે. આકાર, કદનો અંદાજ અને ગોઠવણીનો અહેવાલ આપો. ત્યાં જ અટકો. જો પ્રોટોકોલમાં જાણીતા પોઝિટિવ અને નેગેટિવ નિયંત્રણો સાથે ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ, આયોડિન, વિરંજક અને પ્રતિરંજક વપરાયા હોય, તો તમે ગ્રામ રંગાઈ કરી છે. રંગ સાથે આકારવિજ્ઞાનનો અહેવાલ આપો: સાંકળોમાં જાંબલી ગોળાકાર કોષો, ગુલાબી દંડાકાર કોષો વગેરે.

મોટાભાગની ગૂંચવણ ત્રણ ભૂલોથી ઊભી થાય છે. પહેલી, વાદળી દંડાકાર કોષોને E. coliની પુષ્ટિ તરીકે વધુ પડતો અર્થ આપવો. બીજી, નોંધપોથીમાં મેથિલીન બ્લૂ સ્લાઇડને "ગ્રામ રંગાઈ" શીર્ષક હેઠળ નોંધવી, જેને પછીના વાચકો ખોટી રીતે સમજશે. ત્રીજી, પ્રતિરંજકોને સહજતાથી બદલી દેવા અને પછી જાણે રંગોની શ્રેણી એકસરખી હોય તેમ જુદી પ્રયોગશાળાઓના રંગોની સરખામણી કરવી. દરેક ભૂલનો ઉપાય એક જ છે: ખરેખર કરવામાં આવેલી પદ્ધતિનું નામ આપો અને તે પદ્ધતિ જેનું પરીક્ષણ કરે છે એટલો જ દાવો કરો.

સરળ રંગાઈનું મહત્ત્વ એ જ છે કે તે મર્યાદિત દાવો કરે છે. તે ઝડપી છે, નાની પ્રક્રિયાત્મક ભૂલોને સહન કરે છે અને જ્યારે પ્રશ્ન આકારવિજ્ઞાનનો હોય ત્યારે પૂરતી છે: કંઈ હાજર છે કે નહીં અને તેનો આકાર કેવો છે. જ્યારે પ્રશ્ન વર્ગીકરણનો હોય, ત્યારે ભેદક પરીક્ષણ કરો. વાદળી સ્લાઇડ તમને જણાવે છે કે કોષો કેવા દેખાય છે. જાંબલી કે ગુલાબી સ્લાઇડ જણાવે છે કે તેમની ભિત્તિઓ કેવી રીતે વર્તે છે. કોઈપણ સ્લાઇડ એકલી પ્રજાતિની ઓળખ આપતી નથી.