મેથિલીન બ્લૂ અને નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ: NOS, cGMP અને રક્તવાહિની સંકેતપ્રક્રિયા

પ્રશ્ન સરળ લાગે છે: શું મેથિલીન બ્લૂ નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડને અવરોધે છે? પ્રયોગશાળામાં તેનો જવાબ ચાર અલગ પ્રશ્નોમાં વહેંચાય છે, અને દરેક માટે અલગ પ્રાયોગિક પરીક્ષણ છે. તેમને એકબીજા સાથે ભેળવી દેવા એ મુખ્ય કારણ છે કે મેથિલીન બ્લૂ અને નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ વિશેનું લખાણ આત્મવિશ્વાસપૂર્ણ છતાં અસ્પષ્ટ લાગે છે.

નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડના સંકેતને ચાર કડીઓવાળી સાંકળ તરીકે વિચારો. નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સિન્થેઝ બનાવવા માટે જનીનનું ટ્રાન્સક્રિપ્શન થાય છે. એન્ઝાઇમ આર્જિનિનને નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડમાં રૂપાંતરિત કરે છે. આ વાયુ બીજા કોઈ પદાર્થ સાથે પ્રતિક્રિયા કરે તે પહેલાં પ્રસરણ દ્વારા તેના લક્ષ્ય સુધી પહોંચે છે. દ્રાવ્ય ગ્વાનિલેટ સાયક્લેઝ તેને ઓળખે છે અને ચક્રીય GMP બનાવે છે. દરેક કડી પર મેથિલીન બ્લૂની અસરો પ્રકાશિત થઈ છે, પરંતુ પુરાવા અલગ પ્રાયોગિક તૈયારીઓ, અલગ સાંદ્રતાઓ અને અલગ આઇસોફોર્મમાંથી આવે છે. એક કડી પર મળેલું પરિણામ બીજી કડી પરની ક્રિયા સાબિત કરતું નથી.

પ્રમાણભૂત સાંકળ, સરળ શબ્દોમાં

રક્તવાહિનીની દીવાલમાં પ્રમાણભૂત ક્રમ આ રીતે ચાલે છે. કોઈ ઉત્તેજક એન્ડોથેલિયલ કોષ પર કાર્ય કરે છે. એન્ડોથેલિયલ નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સિન્થેઝ, જેને eNOS અથવા NOS3 કહે છે, નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડનો નાનો સ્પંદ ઉત્પન્ન કરે છે. આ વાયુ બાજુના સુંવાળા સ્નાયુકોષમાં પ્રસરે છે, દ્રાવ્ય ગ્વાનિલેટ સાયક્લેઝના અપચયિત લોહ ધરાવતા હીમ સાથે જોડાય છે અને GTPનું ચક્રીય GMPમાં રૂપાંતર ઝડપી બનાવે છે. ચક્રીય GMP પ્રોટીન કાઇનેઝ Gને સક્રિય કરે છે, કેલ્શિયમના સંચાલનમાં ફેરફાર થાય છે અને સ્નાયુ શિથિલ થાય છે.

બીજી એક સાંકળ પણ છે, જેને અલગ રાખવી જરૂરી છે. ચેપ દરમિયાન અથવા સાયટોકાઇનના સંપર્કમાં આવતા, કોષો એક અલગ એન્ઝાઇમનું ટ્રાન્સક્રિપ્શન કરે છે: પ્રેરિત નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સિન્થેઝ અથવા iNOS, જેને NOS2 પણ કહે છે. તે eNOS કરતાં વધુ મોટા અને લાંબા સમય સુધી ચાલતા નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ પ્રવાહો ઉત્પન્ન કરે છે. ત્રીજું આઇસોફોર્મ, ન્યુરોનલ NOS અથવા nNOS, વળી એક અલગ સંદર્ભ સાથે સંબંધિત છે. જ્યારે કોઈ સંશોધનપત્ર આઇસોફોર્મ જણાવ્યા વિના નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સિન્થેઝનો ઉલ્લેખ કરે, ત્યારે થોભો અને તપાસો કે કયું માપવામાં આવ્યું હતું. મેથિલીન બ્લૂ ઇલેક્ટ્રોનનું સ્થાનાંતરણ કેવી રીતે કરે છે તેની ઝાંખી સામાન્ય રીતે રેડૉક્સ લક્ષ્યો માટે પણ આ જ મુદ્દો સમજાવે છે: સ્થાનાંતરણની આ વ્યવસ્થા પોતે કંઈ કરતી નથી, અને બંને છેડાના ભાગીદારો પરિણામ નક્કી કરે છે.

માપેલું ચક્રીય GMP પણ સંકલિત પરિણામદર્શક માપ છે, સીધું એન્ઝાઇમ પરીક્ષણ નથી. તેનું સ્તર સાયક્લેઝ દ્વારા થતા સંશ્લેષણમાંથી ફૉસ્ફોડાયએસ્ટરેઝ દ્વારા થતા વિઘટનને બાદ કરતાં જે રહે છે તેને દર્શાવે છે; રક્તવાહિનીના સુંવાળા સ્નાયુમાં ખાસ કરીને PDE5 આ વિઘટન કરે છે. તેથી ચક્રીય GMPમાં ઘટાડો એટલે સંકેતગ્રાહક સુધી ઓછો સંકેત પહોંચ્યો. માત્ર તે પરથી કઈ કડી નિષ્ફળ ગઈ તે જાણી શકાતું નથી.

કડી 1: ઓછું iNOS એન્ઝાઇમ બને છે

બેક્ટેરિયલ લિપોપોલિસૅકરાઇડ, ઇન્ટરફેરોન ગૅમા અથવા બંનેથી ઉત્તેજિત ઉંદરના મૅક્રોફેજમાં, મેથિલીન બ્લૂએ iNOS પ્રોટીનમાં અપેક્ષિત વધારો અટકાવ્યો અને મૅક્રોફેજ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રયોગોમાં iNOS મેસેન્જર RNAને નોંધપાત્ર રીતે દબાવ્યો. અહીં માહિતીપ્રદ બાબત એ છે કે શું બદલાયું નહોતું. અવરોધક I કાપ્પા B આલ્ફાનું વિઘટન, NF કાપ્પા B અને STAT1નું ફૉસ્ફોરિલેશન અને આ પરિબળોનું કોષકેન્દ્રમાં સ્થળાંતર મોટા ભાગે યથાવત્ રહ્યાં. જે ઘટ્યું તે તેમનું DNA સાથેનું બંધન હતું; ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશનમાં iNOS પ્રમોટર પર તેમની ઓછી હાજરી જોવા મળતાં તેની પુષ્ટિ થઈ.

આ એન્ઝાઇમના પ્રમાણમાં ફેરફાર પહેલાંના તબક્કે થતી જનીન-નિયામક અસર છે, પહેલેથી હાજર એન્ઝાઇમનો તાત્કાલિક અવરોધ નથી. તે દાહજન્ય સંકેતપ્રક્રિયા સાથે સંબંધિત છે, જેમાં પ્રોટીન બને તે પહેલાં ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોએ પ્રમોટર સાથે જોડાવું પડે છે. તે વિશ્રામાવસ્થાની રક્તવાહિનીમાં સતત હાજર eNOS વિશે સીધું કંઈ કહેતું નથી, અને તેનું વર્ણન એ જ રીતે થવું જોઈએ.

કડી 2: પહેલેથી હાજર NOS એન્ઝાઇમ ધીમું કાર્ય કરે છે

રૅટ પરના એક અભ્યાસમાં અલગ સ્તરનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું. ભાનમાં રહેલા નર રૅટને શિરામાર્ગે લિપોપોલિસૅકરાઇડ આપવામાં આવ્યું, પછી ત્રણ કલાક બાદ શિરામાર્ગે સેલાઇન અથવા 3 mg per kg મેથિલીન બ્લૂ આપવામાં આવ્યું. હાઇપોથેલેમસની NOS પ્રવૃત્તિના અભ્યાસમાં ચિહ્નિત આર્જિનિનનું સિટ્રુલિનમાં રૂપાંતર માપીને હાઇપોથેલેમસના મધ્યવર્તી આધારભૂત ભાગમાં નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સિન્થેઝની પ્રવૃત્તિ માપવામાં આવી. માત્ર તણાવ અને સેલાઇનથી થોડી કેલ્શિયમ-સ્વતંત્ર પ્રવૃત્તિ પ્રેરાઈ, અને લિપોપોલિસૅકરાઇડે તેને નિયંત્રણ સ્તર કરતાં લગભગ દસ ગણી કરી. મેથિલીન બ્લૂએ બંને પ્રેરિત ઘટકો દૂર કર્યા. તે પેશીમાં, તે માત્રાએ અને તે સમયબિંદુએ કેલ્શિયમ-આધારિત સતત હાજર પ્રવૃત્તિ બદલાઈ નહોતી.

આ પરિણામને જે રીતે લખાયું છે તે રીતે જ વાંચો: તે પરિસ્થિતિઓમાં માપેલી iNOS પ્રકારની પ્રવૃત્તિ દબાઈ હતી. આ જનીન અભિવ્યક્તિનું માપન નથી, અને eNOS અથવા nNOSની સરખામણીમાં iNOS માટે કાયમી પસંદગીક્ષમતાનો પુરાવો પણ નથી. શુદ્ધ કરેલા એન્ઝાઇમ પરનું કાર્ય આ સાવચેતીને વધુ સ્પષ્ટ કરે છે. શુદ્ધ કરેલા નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સિન્થેઝના સીધા પરીક્ષણોમાં, મેથિલીન બ્લૂએ 30 micromolar પર સિટ્રુલિનની રચના સંપૂર્ણપણે અટકાવી હતી. શુદ્ધ કરેલા NOS અને ગ્વાનિલેટ સાયક્લેઝની તુલનામાં જણાવ્યા પ્રમાણે, અડધો અવરોધ કરતી સાંદ્રતા સુપરઑક્સાઇડ ડિસમ્યુટેઝ વિના લગભગ 5.3 micromolar અને તેની હાજરીમાં 9.2 micromolar હતી. શુદ્ધ કરેલા nNOSના અલગ અભ્યાસે એન્ઝાઇમ સાથે જોડાયેલા હીમના ઑક્સિડેશનની ભૂમિકા સૂચવી. વ્યવહારુ પાઠ એ છે કે અલગ કરેલી પ્રણાલીઓમાં NOSનો સીધો અવરોધ ખરેખર થાય છે, પરંતુ હાઇપોથેલેમસના પરિણામને વિસ્તારીને એવો સામાન્ય દાવો કરી શકાય નહીં કે મેથિલીન બ્લૂ દરેક જગ્યાએ સતત હાજર તમામ NOSને અપ્રભાવિત રાખે છે.

કડી 3: નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ પહોંચે તે પહેલાં જ નષ્ટ થાય છે

એન્ઝાઇમ અવરોધ સિવાયનું કંઈક પણ ચક્રીય GMPમાં ઘટાડો સમજાવી શકે છે તેનો સૌથી સ્પષ્ટ પુરાવો સંવર્ધિત સસલાની ફેફસાની ધમનીના સુંવાળા સ્નાયુકોષોમાંથી મળે છે. પ્રયોગની રચનામાં સીધા નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ દાતા ઉમેરવાથી આંતરિક NOSની જરૂરિયાત સંપૂર્ણપણે ટાળવામાં આવી, અને પછી રક્તવાહિનીના સુંવાળા સ્નાયુમાં સુપરઑક્સાઇડના અભ્યાસમાં તપાસવામાં આવ્યું કે મેથિલીન બ્લૂ હજુ પણ ચક્રીય GMP પ્રતિભાવને દબાવે છે કે નહીં.

ત્રણ દાતાઓનું 1 થી 100 micromolar સુધી પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું: S નાઇટ્રોસો L સિસ્ટેઇન, સોડિયમ નાઇટ્રોપ્રુસાઇડ અને MPANO નામનું સ્થિર ડિએમિનેટેડ સમરૂપ સંયોજન. બધાએ ચક્રીય GMPને લગભગ 1.5 ગણાથી 12 ગણું વધાર્યું. 10 micromolar મેથિલીન બ્લૂએ પ્રથમ બેના પ્રતિભાવને 51 થી 100 percent અવરોધ્યો અને MPANOનો પ્રતિભાવ યથાવત્ રાખ્યો. જો મેથિલીન બ્લૂ માત્ર સાયક્લેઝના ઉત્પ્રેરક સ્થાનને અવરોધતું હોત, તો દાતાઓ પ્રત્યેની આ પસંદગીક્ષમતા સમજાવવી મુશ્કેલ હોત, કારણ કે ત્રણેય આગળના તબક્કાના એક જ એન્ઝાઇમ પર આવીને મળે છે.

ત્યારબાદ ત્રણ નિયંત્રણ પ્રયોગોએ કાર્યપદ્ધતિને સુપરઑક્સાઇડ સાથે ચોક્કસ રીતે જોડ્યો. પ્રથમ, ઝૅન્થિન અને ઝૅન્થિન ઑક્સિડેઝ દ્વારા કોષની બહાર સુપરઑક્સાઇડ ઉત્પન્ન કરવાથી એ જ પેટર્ન જોવા મળી: CYSNO અને નાઇટ્રોપ્રુસાઇડ અવરોધાયા, જ્યારે MPANO અપ્રભાવિત રહ્યું. બીજું, મેથિલીન બ્લૂએ સુંવાળા સ્નાયુકોષોમાંથી માત્રા અને સમય પર આધારિત સુપરઑક્સાઇડનું ઉત્પાદન કરાવ્યું, જે સાયટોક્રોમ cના અપચય દ્વારા માપવામાં આવ્યું. ત્રીજું, સુપરઑક્સાઇડ ડિસમ્યુટેઝે અવરોધને સંપૂર્ણપણે અટકાવ્યો, જ્યારે કૅટાલેઝે એવું કર્યું નહીં. આથી તે પ્રાયોગિક તૈયારીમાં સીધું જવાબદાર રાસાયણિક સ્વરૂપ હાઇડ્રોજન પેરૉક્સાઇડને બદલે સુપરઑક્સાઇડ હોવાનું સૂચવાય છે.

આ પ્રયોગનું સહ-સંવર્ધન સ્વરૂપ જણાવવું જરૂરી છે, કારણ કે તે અસર ક્યાં થાય છે તે દર્શાવે છે. કવરસ્લિપ પરના એન્ડોથેલિયલ કોષોને થોડા સમય માટે સુંવાળા સ્નાયુકોષો સાથે સહ-સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા, જેથી આધારભૂત રીતે મુક્ત થતા એન્ડોથેલિયલ પરિબળે સુંવાળા સ્નાયુનું ચક્રીય GMP ત્રણથી આઠ ગણું વધાર્યું. કોઈ પણ એક કોષસમૂહને અગાઉથી મેથિલીન બ્લૂના સંપર્કમાં લાવવાથી તે સંકેત ઘટ્યો, અને સુપરઑક્સાઇડ ડિસમ્યુટેઝે એન્ડોથેલિયલ કોષોની પૂર્વ-સારવારની અસરને આંશિક રીતે ઉલટાવી. બીજા શબ્દોમાં, મેથિલીન બ્લૂએ સુંવાળા સ્નાયુના સંકેતગ્રાહક કોષની અંદર જ કાર્ય કરવું જરૂરી નથી. તે માર્ગમાં જ સંદેશવાહકને દૂર કરીને સંકેત ઘટાડી શકે છે. મેથિલીન બ્લૂના સંશોધનને વાંચવાની માર્ગદર્શિકા આને સામાન્ય નિયમ તરીકે લે છે: કોઈ અણુસ્તરીય લક્ષ્યનું નામ આપતાં પહેલાં હસ્તક્ષેપ કયા કોષીય વિભાગમાં થયો તે જણાવો.

આને NOS અવરોધ કહેવું ખોટું હશે. દાતાઓ કાર્ય કરે તે માટે સિન્થેઝનો કોઈ તબક્કો જરૂરી નહોતો, છતાં સંકેત ઘટ્યો.

કડી 4: સંકેતગ્રાહક પોતે ઓછો પ્રતિભાવ આપે છે

દ્રાવ્ય ગ્વાનિલેટ સાયક્લેઝ પર સીધી અસરો થાય છે, પરંતુ સાંદ્રતા મહત્ત્વની છે. ઉપર ઉલ્લેખેલી શુદ્ધ કરેલા એન્ઝાઇમની તુલનામાં, નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડથી ઉત્તેજિત સાયક્લેઝના અડધા અવરોધ માટે લગભગ 60 micromolar મેથિલીન બ્લૂ જરૂરી હતું, જ્યારે NOSના અડધા અવરોધ માટે લગભગ 5 થી 9 micromolar જરૂરી હતું. 1 millimolar પર પણ મહત્તમ અવરોધ માત્ર આંશિક હતો. આ લગભગ છથી અગિયાર ગણો તફાવત છે. તેથી ઓછી micromolar સાંદ્રતાવાળા કોષપ્રયોગમાં ચક્રીય GMP ઘટે, તો માત્ર ચક્રીય GMPના આંકડાના આધારે તેને સાયક્લેઝનો પસંદગીયુક્ત અવરોધ કહી શકાય નહીં.

પછીના એક રેડૉક્સ અભ્યાસે બીજી સાવચેતી ઉમેરેલી: મેથિલીન બ્લૂએ નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડથી સક્રિય થયેલા સાયક્લેઝને એવી કાર્યપદ્ધતિથી નિષ્ક્રિય કર્યો, જે હીમના લોહના હવા દ્વારા થતા સરળ ઑક્સિડેશનથી અલગ હતી. એટલે સંકેતગ્રાહકની કામગીરી બગડી શકે છે, પરંતુ તેની રસાયણિક પ્રક્રિયા હજી નિશ્ચિત નથી. સાંદ્રતાનો તફાવત સૂચવે છે કે ઓછી micromolar સાંદ્રતાના સંપર્કમાં પહેલાં સુપરઑક્સાઇડ અને NOSની અસરોને નકારી કાઢવી જોઈએ. ફૉસ્ફોડાયએસ્ટરેઝનું નિયંત્રણ પણ અહીં જરૂરી બને છે. જ્યાં સુધી વિઘટન માપવામાં કે અવરોધવામાં ન આવ્યું હોય, ત્યાં સુધી ચક્રીય GMPનો ઓછો સંચય ઓછા સંશ્લેષણ, વધુ ઝડપી વિઘટન અથવા બંને સાથે સુસંગત છે.

આને રક્તચાપ વિશેના એક જ દાવામાં કેમ સમાવી શકાય નહીં

દરેક કડી અલગ પ્રણાલીમાં સ્થાપિત થઈ હતી. મૅક્રોફેજનું ટ્રાન્સક્રિપ્શન હાઇપોથેલેમસની એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ નથી. લિપોપોલિસૅકરાઇડ પછીની હાઇપોથેલેમસની પ્રવૃત્તિ વિશ્રામાવસ્થાનો એન્ડોથેલિયલ ટોન નથી. સહ-સંવર્ધનમાં આધારભૂત રીતે મુક્ત થતું એન્ડોથેલિયલ પરિબળ એગોનિસ્ટથી ઉત્તેજિત રક્તવાહિની વિસ્તરણ નથી. 10 micromolar મેથિલીન બ્લૂના સંપર્કમાં આવેલા સંવર્ધિત ફેફસાની ધમનીના કોષો માનવ રક્તપરિભ્રમણ નથી. આ બધાને ભેળવીને “મેથિલીન બ્લૂ નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડને અવરોધીને રક્તચાપ વધારે છે” એવું કહેવું એ ચોક્કસ ભેદોને જ કાઢી નાખે છે, જેને જાળવવા માટે નિયંત્રણ પ્રયોગો રચાયા હતા.

ત્રણ તપાસો વર્ણનને તથ્યનિષ્ઠ રાખે છે. પ્રથમ, આઇસોફોર્મનું નામ જણાવો: વિશ્રામાવસ્થાના રક્તવાહિની ટોન માટે eNOS, પ્રેરિત દાહજન્ય પ્રવાહ માટે iNOS, અને ન્યુરોનલ તથા કેટલાક શુદ્ધ કરેલા એન્ઝાઇમના સંદર્ભો માટે nNOS. બીજું, નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ સંકેત કેવી રીતે પહોંચાડાયો તે જણાવો: આંતરિક સંશ્લેષણ, આધારભૂત એન્ડોથેલિયલ મુક્તિ અથવા CYSNO, નાઇટ્રોપ્રુસાઇડ કે MPANO જેવા ચોક્કસ દાતા દ્વારા; કારણ કે સ્થિર દાતાએ મેથિલીન બ્લૂની અસરનો પ્રતિકાર કર્યો હતો, જ્યારે અસ્થિર દાતાઓએ કર્યો નહોતો. ત્રીજું, સાંદ્રતા અને અસર ઉલટાવતી પરિસ્થિતિ જણાવો: સુપરઑક્સાઇડ ડિસમ્યુટેઝ દ્વારા અસર ઉલટાવવી સુપરઑક્સાઇડની ભૂમિકા સૂચવે છે, કૅટાલેઝની નિષ્ફળતા તે પ્રાયોગિક તૈયારીમાં હાઇડ્રોજન પેરૉક્સાઇડની ભૂમિકા સામે પુરાવો આપે છે, ઝૅન્થિન ઑક્સિડેઝ દ્વારા સમાન અસર થવી તે કારણ પૂરતું હોવાનું દર્શાવે છે, અને શુદ્ધ કરેલા એન્ઝાઇમના પરીક્ષણો સીધી ઉત્પ્રેરક અસરોને માર્ગમાં થતા સંકેતના નુકસાનથી અલગ પાડે છે.

સંક્ષિપ્ત સાર આ છે. મેથિલીન બ્લૂને પસંદગીયુક્ત સાયક્લેઝ અવરોધક કરતાં નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડથી ચક્રીય GMP સુધીની સંકેતપ્રક્રિયામાં અનેક સ્થળે ખલેલ પહોંચાડતા પદાર્થ તરીકે સમજવું વધુ યોગ્ય છે. પ્રાયોગિક તૈયારી અને સાંદ્રતા પ્રમાણે, તે iNOSના ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોનું બંધન ઘટાડી શકે છે, NOS એન્ઝાઇમોને સીધા અવરોધી શકે છે, સુપરઑક્સાઇડ ઉત્પન્ન કરીને નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડની ઉપલબ્ધતા ઘટાડી શકે છે અને નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડથી સક્રિય થયેલા સાયક્લેઝની કામગીરી બગાડી શકે છે. રક્તવાહિનીના અભ્યાસોમાં ચક્રીય GMP સંકેતપ્રક્રિયાની ભૂમિકા અને કોષ પરીક્ષણોમાં વપરાતા નાઇટ્રિક ઑક્સાઇડ દાતાઓની તુલના આમાંથી એક-એક શાખાને વધુ વિગતે સમજાવે છે, અને રેડૉક્સ અસરોને એન્ઝાઇમ અસરોથી અલગ પાડવા માટે વપરાતી પદ્ધતિઓ સમજાવે છે કે આ સંશોધન સાહિત્યમાં સુપરઑક્સાઇડ ડિસમ્યુટેઝ, કૅટાલેઝ અને સ્થિર દાતાનું નિયંત્રણ સાથે આટલી વાર કેમ જોવા મળે છે.

મેથિલીન બ્લૂ પછી ચક્રીય GMPનું ઓછું મૂલ્ય સાંકળ તૂટી હોવાનું દર્શાવે છે. કઈ કડી તૂટી તે માત્ર નિયંત્રણ પ્રયોગો જ જણાવે છે.