મેથિલીન બ્લૂનો ઉપયોગ એસિડ-ફાસ્ટ કાઉન્ટરસ્ટેઇન તરીકે શા માટે થાય છે

એક ટેકનિશિયન રંગનની સંપૂર્ણ પ્રક્રિયા પછી ગળફાના સ્મિયરની તપાસ કરે છે. વાદળી ક્ષેત્ર સામે લાલ દંડાકાર જીવાણુઓ સ્પષ્ટ દેખાય છે, અને અહેવાલમાં એસિડ-ફાસ્ટ બેસિલાઈ જોવા મળ્યા હોવાનું લખાય છે. બીજા દિવસે એક અલગ સ્લાઇડ પર લાલ દંડાકાર જીવાણુઓ વિના એકસરખું વાદળી ક્ષેત્ર દેખાય છે, અને તેના અહેવાલમાં ક્ષયરોગ માટે નકારાત્મક હોવાનું લખાય છે. આ બે અહેવાલોમાંથી એક સ્લાઇડ જેટલું સમર્થન આપે છે તેના કરતાં વધુ દાવો કરે છે, અને તે પહેલો અહેવાલ નથી.

આ ગૂંચવણ ખ્યાલની છે. ટેકનિશિયને વાદળી રંગદ્રવ્યને શોધ માટેની રાસાયણિક પ્રક્રિયાનો ભાગ માન્યું, જાણે મેથિલીન બ્લૂ માયકોબેક્ટેરિયાને શોધવામાં મદદ કરતું હોય. એવું નહોતું. મેથિલીન બ્લૂ સ્લાઇડને સ્પર્શે ત્યાં સુધીમાં પરીક્ષણ પૂરું થઈ ચૂક્યું હોય છે. રંગદ્રવ્ય માત્ર પૃષ્ઠભૂમિને રંગે છે જેથી પરિણામ વાંચી શકાય. આ લેખ એસિડ-ફાસ્ટ રંગનમાં મેથિલીન બ્લૂનો હેતુ, બીજા કોઈ રંગને બદલે વાદળી રંગ જ શા માટે વપરાય છે, અને વાદળી પૃષ્ઠભૂમિ સામે લાલ રંગ પરથી તમે કયા નિષ્કર્ષ કાઢી શકો તે સમજાવે છે.

ટૂંકો જવાબ

એસિડ-ફાસ્ટ રંગન ત્રણ ખ્યાલો પર આધારિત ભેદકારી પરીક્ષણ છે. મુખ્ય રંગદ્રવ્ય કાર્બોલ ફ્યુક્સિનને મીણ જેવા આવરણવાળા માયકોબેક્ટેરિયા સહિત દરેક કોષમાં પ્રવેશાવવામાં આવે છે. રંગ દૂર કરનાર એસિડ-આલ્કોહોલ સામાન્ય કોષોમાંથી લાલ રંગદ્રવ્ય કાઢી નાખે છે, પરંતુ એસિડ-ફાસ્ટ કોષોમાંથી તેને કાઢી શકતું નથી. ત્યાર પછી કાઉન્ટરસ્ટેઇન મેથિલીન બ્લૂ એવા બધાને રંગે છે જેમાંથી રંગ દૂર કરનારે રંગ કાઢી નાખ્યો હોય. તેથી બિન-એસિડ-ફાસ્ટ કોષો, યજમાન કોષો અને કોષીય અવશેષો વાદળી દેખાય છે, જ્યારે એસિડ-ફાસ્ટ બેસિલાઈ લાલ જ રહે છે. કાઉન્ટરસ્ટેઇન રંગવિરોધ પૂરો પાડે છે. કોષને એસિડ-ફાસ્ટ બનાવતી રાસાયણિક પ્રક્રિયામાં તેની કોઈ ભૂમિકા નથી.

દરેક પગલું શું કરે છે

નીચેનો આલેખ કામની વહેંચણી બતાવે છે. તેને પ્રક્રિયા તરીકે ડાબેથી જમણે વાંચો, અને નીચેની પટ્ટીને એ યાદ અપાવતી માહિતી તરીકે વાંચો કે રંગનની દરેક પદ્ધતિનો સમૂહ અલગ પ્રશ્ન પૂછે છે.

પ્રવેશ પ્રથમ આવે છે. માયકોબેક્ટેરિયાનું આવરણ અસામાન્ય રીતે જલવિરોધી હોવાથી તે સામાન્ય જલીય રંગદ્રવ્યોના પ્રવેશનો પ્રતિકાર કરે છે, તેથી પ્રોટોકોલ રંગદ્રવ્યને અંદર પ્રવેશાવે છે. ઝીલ-નીલસન પદ્ધતિમાં, વરાળ ઊઠે એટલી ગરમી આપવાથી ફિનોલ ધરાવતું કાર્બોલ ફ્યુક્સિન મીણ જેવી કોષભિત્તિમાંથી અંદર જાય છે. કિન્યૌન શીત પદ્ધતિમાં, ગરમીને બદલે મુખ્ય રંગદ્રવ્યનું ઘણું વધુ પ્રબળ સંયોજન વપરાય છે, અને કેટલીક સુધારેલી ગરમી વિનાની આવૃત્તિઓમાં સર્ફેક્ટન્ટ ઉમેરવામાં આવે છે. અમેરિકન સોસાયટી ફોર માઇક્રોબાયોલોજીના એસિડ-ફાસ્ટ રંગન પ્રોટોકોલ બંને સંયોજનોને બાજુબાજુ નોંધે છે, અને સાંદ્રતાનો તફાવત નોંધપાત્ર છે: ગરમીવાળી પદ્ધતિમાં દર 100 mL દીઠ લગભગ 0.3 g બેઝિક ફ્યુક્સિન, જ્યારે શીત પદ્ધતિમાં લગભગ 4 g.

ભેદકરણ બીજું આવે છે. એસિડ-આલ્કોહોલ, જે સામાન્ય રીતે 95 ટકા ઇથેનોલના 97 mL માં સાંદ્ર હાઇડ્રોક્લોરિક એસિડના 3 mL હોય છે, એવા દરેક કોષમાંથી લાલ રંગદ્રવ્ય ધોઈ કાઢે છે જેની કોષભિત્તિ કોઈ વિશેષ પ્રતિકાર આપતી નથી. અખંડ માયકોબેક્ટેરિયલ લિપિડ આવરણ ધરાવતા કોષો રંગદ્રવ્ય જાળવી રાખે છે. આખી પદ્ધતિ આ પગલા પર આધારિત છે, અને નીચે ચર્ચા કર્યા મુજબ, આ જ પગલું કાર્યપદ્ધતિ પ્રત્યે સૌથી વધુ સંવેદનશીલ છે.

રંગવિરોધ છેલ્લે આવે છે. હવે સ્લાઇડ પર રંગ ગુમાવી ચૂકેલા કોષોની લગભગ રંગહીન પૃષ્ઠભૂમિ પર લાલ એસિડ-ફાસ્ટ કોષો હોય છે. 0.3 ટકા w/v મેથિલીન બ્લૂ આ પૃષ્ઠભૂમિને લાલથી મહત્તમ અલગ રંગમાં ફરી દૃશ્યમાન બનાવે છે. કાઉન્ટરસ્ટેઇનિંગ ટૂંકું હોય છે: ગરમીવાળી પદ્ધતિમાં સામાન્ય રીતે 20 થી 30 સેકન્ડ અને શીત પદ્ધતિની કેટલીક આવૃત્તિઓમાં થોડી મિનિટ સુધી. આ સમયગાળો પ્રોટોકોલ પર આધારિત છે, રંગદ્રવ્યનો પોતાનો ગુણધર્મ નથી.

આ રંગદ્રવ્ય શા માટે, અને વાદળી શા માટે

મેથિલીન બ્લૂ ધનાયનિક બેઝિક રંગદ્રવ્ય છે. એટલે કે તેનો રંગીન આયન ધન વિદ્યુતભાર ધરાવે છે અને રંગહીન થયેલા બેક્ટેરિયા, યજમાન કોષો તથા કોષીય અવશેષોની ઋણ વિદ્યુતભાર ધરાવતી સપાટીઓ સાથે બંધાય છે. ઓપનસ્ટેક્સ માઇક્રોબાયોલોજી વિદ્યુતભારના આ તર્કને બેઝિક રંગદ્રવ્યો પાછળનો સામાન્ય સિદ્ધાંત તરીકે વર્ણવે છે. પરંતુ અહીં મેથિલીન બ્લૂ રાસાયણિક રીતે અનન્ય નથી. ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ અને સેફ્રેનિન પણ બેઝિક રંગદ્રવ્યો છે. આ પસંદગી પ્રકાશીય છે, રાસાયણિક નહીં.

લાલ દંડાકાર જીવાણુઓને વિરોધી રંગની પૃષ્ઠભૂમિ જોઈએ છે, અને બ્રાઇટ-ફીલ્ડ માઇક્રોસ્કોપી માટે વાદળી રંગ લાલની સામે સૌથી ઉપયોગી રંગવિરોધ આપે છે. સેફ્રેનિન નબળું કાઉન્ટરસ્ટેઇન સાબિત થાય, કારણ કે તેનો અંતિમ ગુલાબી-લાલ રંગ જળવાયેલા કાર્બોલ ફ્યુક્સિનના રંગની ખૂબ નજીક છે, જેથી પ્રક્રિયાએ ઊભો કરેલો ભેદ જ ભૂંસાઈ જાય. ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ ઘેરી જાંબલી પૃષ્ઠભૂમિ આપે, જે પાતળા લાલ બેસિલાઈ સાથે ધ્યાન ખેંચવા માટે સ્પર્ધા કરે. અહીં કામ રાસાયણિક પ્રક્રિયાનું નહીં પરંતુ રંગવિરોધનું છે, તેનો સૌથી મજબૂત પુરાવો રંગદ્રવ્ય બદલવાથી મળે છે: મેલાકાઇટ ગ્રીન અને બ્રિલિયન્ટ ગ્રીન જેવા લીલા કાઉન્ટરસ્ટેઇન કેટલીક પશુચિકિત્સા અને સુધારેલી પદ્ધતિઓમાં વપરાય છે, અને પરીક્ષણ ત્યારે પણ કામ કરે છે, કારણ કે સ્પષ્ટ રીતે જુદો દેખાતો કોઈ પણ રંગ એ જ કાર્ય કરે છે.

આમાંથી બે વ્યવહારુ તારણ મળે છે. પ્રથમ, પ્રમાણભૂત સંયોજનમાં pH સમાયોજન સૂચવેલું નથી; આ સાદા જલીય 0.3 ટકા દ્રાવણને લોફલરના મેથિલીન બ્લૂ જેવા ક્ષારીય સંયોજનો સાથે ગૂંચવશો નહીં, કારણ કે તે રંગનના અલગ ખ્યાલ સાથે સંબંધિત છે. બીજું, વધુ પડતો ઉપયોગ નુકસાન કરે છે. પેશીવિજ્ઞાનનું સાહિત્ય ખાસ ચેતવે છે કે અતિઘેરી વાદળી પૃષ્ઠભૂમિ ઓછી સંખ્યામાં રહેલા બેસિલાઈને ઢાંકી શકે છે. તેથી પ્રોટોકોલમાં મંજૂર સમય કરતાં વધુ સમય સુધી સ્લાઇડને રંગદ્રવ્યથી ઢાંકેલી રાખવાથી કોઈ લાભ વિના વાંચવાની સ્પષ્ટતા ઘટે છે.

પરીક્ષણને શક્ય બનાવતી કોષભિત્તિની રસાયણિક રચના

એસિડ-આલ્કોહોલ ભેદ કરી શકે તેનું કારણ માયકોબેક્ટેરિયાના આવરણમાં રહેલું છે. તેનું માળખાકીય કેન્દ્ર માયકોલિલ-એરેબિનોગેલેક્ટન-પેપ્ટિડોગ્લાયકેન સંકુલ છે: પેપ્ટિડોગ્લાયકેન એરેબિનોગેલેક્ટન સાથે જોડાયેલું હોય છે, જેના બહારના છેડે ખૂબ લાંબી શૃંખલાવાળા માયકોલિક એસિડ હોય છે. તે અસામાન્ય રીતે ઓછી પારગમ્યતા ધરાવતું, લિપિડથી સમૃદ્ધ બાહ્ય માયકોમેમ્બ્રેન બનાવે છે. માયકોબેક્ટેરિયાના બાહ્ય પટલની સમીક્ષા આ રચનાની વિગત આપે છે. આ અવરોધ બંને દિશામાં કામ કરે છે. તે રંગદ્રવ્યના પ્રવેશનો પ્રતિકાર કરે છે, તેથી પ્રવેશ માટે ગરમી અથવા વધુ પ્રબળ મુખ્ય રંગદ્રવ્ય જોઈએ છે. તે રંગદ્રવ્ય બહાર કાઢવાનો પણ પ્રતિકાર કરે છે, તેથી કાર્બોલ ફ્યુક્સિન અંદર ગયા પછી એસિડ-આલ્કોહોલ તેને દૂર કરી શકતું નથી. સામાન્ય બેક્ટેરિયામાં આ આવરણ નથી હોતું અને તે રંગદ્રવ્ય ગુમાવે છે. તેથી એસિડ-ફાસ્ટ ગુણધર્મને ફ્યુક્સિન માયકોલિક એસિડ સાથે રાસાયણિક રીતે બંધાય છે એમ સમજવાને બદલે લિપિડ અવરોધની ઘટના તરીકે સમજવું વધુ યોગ્ય છે.

આ રાસાયણિક રચના એક સામાન્ય મૂંઝવણ પણ સમજાવે છે: ગ્રામ પદ્ધતિથી માયકોબેક્ટેરિયા નબળા અને અનિશ્ચિત રીતે રંગાય છે, અને ક્યારેક ઝાંખાં મણકા જેવા સ્વરૂપો અથવા રંગ ન પકડેલી ભૂતિયા આકૃતિઓ તરીકે દેખાય છે. તેમની જલવિરોધી કોષભિત્તિ ક્રિસ્ટલ વાયોલેટના પ્રવેશને મર્યાદિત કરે છે. એસિડ-ફાસ્ટ રંગન સુધારેલું ગ્રામ રંગન નથી. તે કોષભિત્તિના અલગ ગુણધર્મ પર આધારિત અલગ ભેદકારી સિદ્ધાંત છે, જેમ અન્ય બે પદ્ધતિઓ માટે સરળ રંગન અને ગ્રામ રંગનની તુલના બતાવે છે.

ત્રણ પદ્ધતિઓ, ત્રણ પ્રશ્નો

એક રંગદ્રવ્ય વાપરતી બેક્ટેરિયલ પદ્ધતિઓના વિશાળ સમૂહ માટે, માઇક્રોસ્કોપી રંગન એટલાસ જુઓ.

વાદળી સામે લાલ રંગ શું સાબિત કરી શકતો નથી

લાલ દંડાકાર જીવાણુઓનો અર્થ એ છે કે સજીવોએ એસિડ-આલ્કોહોલની પ્રક્રિયા દરમિયાન કાર્બોલ ફ્યુક્સિન જાળવી રાખ્યું. આ નિરીક્ષણ માયકોબેક્ટેરિયમ ટ્યુબરક્યુલોસિસ સાથે સુસંગત છે, પરંતુ CDCનું ક્ષયરોગ નિદાન માર્ગદર્શન સ્પષ્ટ રીતે નોંધે છે કે અન્ય માયકોબેક્ટેરિયા પણ એસિડ-ફાસ્ટ હોય છે. તેથી પ્રજાતિની ઓળખ માટે કલ્ચર અને ન્યુક્લિક એસિડ પરીક્ષણ જોઈએ, રંગ નહીં.

કાર્યપદ્ધતિની ભૂલો મુખ્યત્વે ધોવાના બે તબક્કાની આસપાસ થાય છે. ઓછું રંગવિહીનીકરણ પૃષ્ઠભૂમિની સામગ્રીને લાલ રાખે છે અને ખોટા સકારાત્મક અર્થઘટનની શક્યતા ઊભી કરે છે. વધુ પડતું રંગવિહીનીકરણ નબળી રીતે જળવાયેલું મુખ્ય રંગદ્રવ્ય કાઢી નાખે છે અને ખોટા નકારાત્મક પરિણામોમાં ફાળો આપે છે. ખૂબ વધારે લગાવેલું કાઉન્ટરસ્ટેઇન ઓછી સંખ્યામાં રહેલા બેસિલાઈને વાદળી રંગમાં ઢાંકી દે છે. જાડા સ્મિયર, અવક્ષેપિત અભિકર્મકો અને દૂષિત ધોવાનું પાણી પોતપોતાની કૃત્રિમ રચનાઓ ઉમેરે છે.

કાર્યપદ્ધતિ ગમે તેટલી ચોક્કસ હોય, સંવેદનશીલતા સજીવોની સંખ્યાથી મર્યાદિત રહે છે. પરંપરાગત સ્મિયર માઇક્રોસ્કોપી માટે ગળફાના દર મિલિલિટરમાં લગભગ 5,000 થી 10,000 બેસિલાઈ જરૂરી હોય છે, અને CDCની અગાઉની પુરાવા સમીક્ષાઓમાં કલ્ચરથી પુષ્ટિ થયેલા ફેફસાના કેસોમાં સ્મિયરની સંવેદનશીલતા લગભગ 45 થી 80 ટકા દર્શાવાઈ હતી. તેથી નકારાત્મક સ્મિયર ક્યારેય ક્ષયરોગને નકારી શકતું નથી. હાલનું CDC માર્ગદર્શન દરેક સ્મિયર સાથે કલ્ચર રાખે છે અને જ્યારે ફેફસાના ક્ષયરોગની શક્યતા વિચારવામાં આવતી હોય તથા પરિણામથી સંભાળના નિર્ણયમાં ફેરફાર થવાનો હોય, ત્યારે શ્વસનતંત્રના ઓછામાં ઓછા એક નમૂના પર ન્યુક્લિક એસિડ એમ્પ્લિફિકેશન પરીક્ષણ કરવાની ભલામણ કરે છે.

વ્યવહારુ કાર્ય અધિકૃત પ્રોટોકોલ મુજબ જ થવું જોઈએ

આ લેખ સહિતના શૈક્ષણિક વર્ણનો ક્લિનિકલ કાર્ય માટે અધિકૃતતા આપતાં નથી. પ્રયોગશાળાના કાર્ય માટે, વર્તમાન CDC, APHL અથવા CLSI દસ્તાવેજો સાથે સુસંગત પ્રયોગશાળાની માન્ય પ્રમાણભૂત કાર્યપદ્ધતિ અનુસરો; CDCના Stacks સંગ્રહમાં રહેલો એસિડ-ફાસ્ટ રંગન સંદર્ભ બતાવે છે કે આવી પદ્ધતિઓ અભિકર્મકો અને પરિણામના વાંચનને કેવી રીતે નિર્દિષ્ટ કરે છે. ક્ષયરોગના નમૂનાઓ સાથેના કાર્યમાં જૈવસુરક્ષા માટે નિયંત્રિત વ્યવસ્થા જરૂરી છે: સ્મિયર જૈવિક સલામતી કેબિનેટમાં તૈયાર કરવામાં આવે છે, કારણ કે તૈયાર કરવાની પ્રક્રિયા એરોસોલ અને છાંટા પેદા કરે છે. CDCનું પ્રયોગશાળા સલામતી માર્ગદર્શન જણાવે છે કે ગરમીથી સ્થિર કરેલા સ્મિયરમાં પણ જીવંત ક્ષય બેસિલાઈ હોઈ શકે છે અને તેમને હજુ પણ દૂષિત માનીને હેન્ડલ કરવા જોઈએ. M. leprae માટે તપાસાયેલા કાર્બોલ-ફ્યુક્સિન અને મેથિલીન બ્લૂ સ્મિયર વિશેની CDC પબ્લિક હેલ્થ ઇમેજ લાઇબ્રેરીની નોંધ ક્ષયરોગથી આગળ આ પદ્ધતિના વ્યાપની ઉપયોગી યાદ અપાવે છે: જ્યાં પણ એસિડ-ફાસ્ટ સજીવો શોધવામાં આવે છે ત્યાં વાદળી પર લાલનો એ જ રંગવિરોધ કામ કરે છે, અને કાળજીપૂર્વક કરાયેલું નકારાત્મક વાંચન પણ નોંધવા યોગ્ય પરિણામ છે.

તૈયાર સ્લાઇડનું વાંચન

પ્રાથમિક તપાસ દરમિયાન કાઉન્ટરસ્ટેઇનની ઉપયોગિતા સ્પષ્ટ થાય છે. ઓછી આવર્ધન શક્તિએ સ્લાઇડ તપાસતો માઇક્રોસ્કોપિસ્ટ પ્રથમ વાદળી પૃષ્ઠભૂમિનો ઉપયોગ સ્મિયરની ગુણવત્તા આંકવા માટે કરે છે: કોષોનું સમાન વિતરણ, ફોકસ કરવા માટે અખંડ યજમાન કોષો, અને વધુ અવક્ષેપનો અભાવ. ત્યાર પછી લાલ સંભવિત જીવાણુઓ નજર ખેંચે છે, કારણ કે સ્લાઇડ પર બીજું કશું લાલ હોતું નથી. પુષ્ટિ ઓઇલ ઇમર્શન હેઠળ થાય છે, જ્યાં સાચા બેસિલાઈ એકસરખા રંગદ્રવ્યના અવશેષોને બદલે અપેક્ષિત પાતળા, ક્યારેક સહેજ વળેલા અથવા મણકા જેવા દંડાકાર સ્વરૂપો દર્શાવે છે.

પૃષ્ઠભૂમિનું રંગન અહેવાલની શબ્દાવલી પણ નક્કી કરે છે. લાલ બેસિલાઈ ધરાવતી સ્લાઇડનો અહેવાલ એસિડ-ફાસ્ટ બેસિલાઈ જોવા મળ્યા તરીકે આપવામાં આવે છે, ઘણી વખત પ્રયોગશાળાના માપદંડ મુજબ અર્ધપરિમાણાત્મક શ્રેણી સાથે. લાલ સજીવો વિનાની સ્લાઇડનો અહેવાલ કોઈ એસિડ-ફાસ્ટ બેસિલાઈ જોવા મળ્યા નથી તરીકે આપવામાં આવે છે, ક્યારેય ક્ષયરોગ માટે નકારાત્મક તરીકે નહીં. આ ભેદ મહત્વનો છે, કારણ કે વાદળી ક્ષેત્ર સાબિત કરે છે કે રંગન કામ કરતું હતું, કોષોએ કાઉન્ટરસ્ટેઇન ગ્રહણ કર્યું હતું અને પ્રકાશીય વ્યવસ્થા પૂરતી હતી, પરંતુ શોધમર્યાદાથી નીચે રહેલા સજીવો વિશે તે કશું કહેતું નથી. લાલ સજીવો વિનાનું વાદળી ક્ષેત્ર સ્લાઇડ વિશેનું માન્ય પરિણામ છે, દર્દી વિશેનો ચુકાદો નહીં.

કામની વહેંચણી યાદ રાખશો તો અહેવાલમાં શું લખવું તે સ્પષ્ટ રહેશે. કાર્બોલ ફ્યુક્સિન સંભવિત જીવાણુઓ દર્શાવે છે. એસિડ-આલ્કોહોલ પરીક્ષણ કરે છે. મેથિલીન બ્લૂ માત્ર જવાબને વાંચી શકાય એવો બનાવે છે: લાલે એસિડ સામે રંગદ્રવ્ય જાળવી રાખ્યું, વાદળીએ તે ગુમાવ્યું. બાકી બધું—પ્રજાતિ, સજીવોની સંખ્યા અને ક્લિનિકલ અર્થ—સ્લાઇડની બહાર કરવામાં આવતા કાર્યમાંથી મળે છે.