લોફ્લરના ક્ષારીય અને પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ અભિરંજકોની સમજ

અભિરંજન માટેના કાર્યમેજ પર ત્રણ બોટલ બાજુબાજુમાં હોઈ શકે છે, અને દરેક પર મેથિલીન બ્લૂના કોઈ ને કોઈ પ્રકારનું લેબલ હોય છે. એક પર જલીય મેથિલીન બ્લૂ 1% લખેલું છે. બીજી પર લોફ્લરનું ક્ષારીય મેથિલીન બ્લૂ લખેલું છે. ત્રીજી પર પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ લખેલું છે. કામમાં વ્યસ્ત કર્મચારી સૌથી નજીકની બોટલ ઉપાડી લે છે. પછી સ્મિયર બહુ ઝાંખો રંગાય છે, અથવા બધો એકસરખો વાદળી રંગાય છે, અથવા તેમાં જાંબલી રંગની અણધારી છટાઓ દેખાય છે, અને પરિણામ માટે નમૂનાને દોષ આપવામાં આવે છે.

આ દ્રાવણની બનાવટની સમસ્યા છે, નમૂનાની નહીં. આ ત્રણ દ્રાવણોમાં સંબંધિત રંગદ્રવ્યો હોય છે, પરંતુ તેમના અભિરંજનના ખ્યાલો જુદા છે. એક લગભગ તટસ્થ pH પરનું સાદું ધનાયનિક રંગદ્રવ્ય છે. બીજું એ જ રંગદ્રવ્ય છે, જેને ક્ષાર ઉમેરીને વધુ પ્રબળ બનાવવામાં આવ્યું છે. ત્રીજું તો હવે એક જ રંગદ્રવ્ય રહ્યું નથી, પરંતુ ઇરાદાપૂર્વક ઓક્સિડેશન કરેલું મિશ્રણ છે. ખોટું દ્રાવણ વાપરો તો તમારા હાથમાં જ અભિરંજનનો સિદ્ધાંત બદલાઈ જાય છે.

ટૂંકો જવાબ

સાદું જલીય મેથિલીન બ્લૂ આધારરૂપ છે: પાણીમાં લગભગ 1% રંગદ્રવ્ય, જે બેક્ટેરિયાના આકારવિજ્ઞાન અને સામાન્ય સૂક્ષ્મદર્શક અવલોકન માટેનું સાદું ધનાયનિક અભિરંજક છે. લોફ્લરના ક્ષારીય મેથિલીન બ્લૂમાં પાણીથી પાતળા કરેલા આલ્કોહોલિક સ્ટોક દ્રાવણમાં મંદ ક્ષારની થોડી માપેલી માત્રા ઉમેરાય છે. આથી pH વધે છે અને ધનાયનિક રંગદ્રવ્ય બેક્ટેરિયાની અમ્લીય રચનાઓ સાથે વધુ પ્રબળ રીતે બંધાય છે. પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ એ એવું મેથિલીન બ્લૂ છે જેને ક્ષારીય માધ્યમમાં ઓક્સિડેશન દ્વારા ઇરાદાપૂર્વક પરિપક્વ કરવામાં આવ્યું હોય. તેથી બોટલમાં બાકી રહેલા મેથિલીન બ્લૂની સાથે ડીમિથાઇલેટ થયેલા સમધર્મી રંગદ્રવ્યો (azure A, azure B, azure C), થાયોનિન અને મેથિલીન વાયોલેટનું મિશ્રણ હોય છે, અને આ મિશ્રણ વિવિધ રચનાઓને વિવિધ રંગછટાઓમાં રંગે છે.

જો માત્ર એક જ વાક્ય યાદ રાખવું હોય તો: ક્ષારીકરણ અભિરંજનની તીવ્રતા બદલે છે, જ્યારે પોલીક્રોમિંગ અભિરંજનના રંગો બદલે છે.

સામાન્ય જલીય મેથિલીન બ્લૂ: સંદર્ભબિંદુ

સૌથી સરળ બનાવટ પાણીમાં ઓગાળેલું મેથિલીન બ્લૂ છે, સામાન્ય રીતે 1% w/v સાંદ્રતા પર, જેમાં ક્ષાર ઉમેરાયેલો હોતો નથી અને ઓક્સિડેશન કરેલું હોતું નથી. રંગીન રાસાયણિક સ્વરૂપ ક્લોરાઇડ પ્રતિઆયન સાથેનો મિથાઇલથાયોનિનિયમ ધનાયન છે. આ નાનું, સપાટ ફીનોથાયાઝિન રંગદ્રવ્ય છે, જેને PubChemની મેથિલીન બ્લૂ નોંધમાં મિથાઇલથાયોનિનિયમ ક્લોરાઇડ તરીકે વર્ણવવામાં આવ્યું છે. ધનાયન તરીકે તે ન્યુક્લિક એસિડના ફોસ્ફેટ આધારમાળખા અને બેક્ટેરિયાની કોષભિત્તિઓ પરના અમ્લીય સમૂહો સાથે બંધાય છે, અને હળવા રંગની પૃષ્ઠભૂમિ સામે કોષોને વાદળી રંગે છે.

તેનો ગુણ તેની અનુમાનક્ષમતા છે. કેન્દ્રકો અને બેક્ટેરિયા વાદળી દેખાય છે. રંગભેદ મર્યાદિત હોય છે. ઝાંખા દેખાતા સૂક્ષ્મજીવો નબળા રંગાઈ શકે છે; લોફ્લર આ જ મર્યાદા દૂર કરવા માગતા હતા. આ દ્રાવણ જે સાદા બેક્ટેરિયલ અભિરંજકોના વ્યાપક વર્ગમાં આવે છે તેની સમજ માટે બેક્ટેરિયાના સાદા અભિરંજનનો વિહંગાવલોકન જુઓ. અહીં પણ રંગદ્રવ્યની ઓળખની ચોકસાઈ મહત્વની છે: મિથાઇલ બ્લૂ સાવ અલગ અણુ છે, જેમ મિથાઇલ બ્લૂ અને મેથિલીન બ્લૂ વચ્ચેનો તફાવત સમજાવે છે. તેથી માત્ર રંગના નામના આધારે કેટલોગમાં શોધ કરવાથી ખોટા વર્ગનું રંગદ્રવ્ય મળી શકે છે.

લોફ્લરનું ક્ષારીય મેથિલીન બ્લૂ: એ જ રંગદ્રવ્ય, વધુ પ્રબળ અસર

લોફ્લરની પરંપરાગત બનાવટમાં આલ્કોહોલિક મેથિલીન બ્લૂ સ્ટોક દ્રાવણને પાણીમાંના મંદ ક્ષાર સાથે ભેળવવામાં આવે છે. પાઠ્યપુસ્તકોમાં આપેલી બનાવટ મુજબ 95% ઇથેનોલના 30 mLમાં 0.3 g રંગદ્રવ્ય સાથે 0.01% જલીય પોટેશિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડના 100 mL ઉમેરવામાં આવે છે (અથવા સમકક્ષ રીતે સંતૃપ્ત આલ્કોહોલિક મેથિલીન બ્લૂના 30 mL, નિસ્યંદિત પાણીના 100 mL અને 1% KOHના 1 mL). આથી સ્પષ્ટપણે ક્ષારીય pH પર લગભગ 0.3% રંગદ્રવ્ય ધરાવતું કાર્યકારી દ્રાવણ મળે છે. વ્યાપારી બનાવટો પણ આ જ સિદ્ધાંત અનુસરે છે, અને Thermo Fisherનો સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાન અભિરંજકોનો કેટલોગ લોફ્લરના ક્ષારીય મેથિલીન બ્લૂ, પોલીક્રોમ અને જલીય પ્રકારોને અલગ હેતુ ધરાવતી અલગ કેટલોગ વસ્તુઓ તરીકે સૂચવે છે.

ક્ષાર ઉમેરવો એ અહીંનો મુખ્ય કાર્યકારી ખ્યાલ છે. pH વધારવાથી નમૂના પરના કાર્બોક્સિલ અને ફોસ્ફેટ સમૂહોમાંથી પ્રોટોન દૂર થાય છે, અને ઋણભારિત સ્થળોની ઘનતા વધે છે. આલ્કોહોલિક સ્ટોક રંગદ્રવ્યને સંપૂર્ણપણે ઓગળેલું રાખે છે, જેથી તે આ સ્થળોએ એકલ અણુના સ્વરૂપમાં પહોંચે છે. પરિણામે તટસ્થ જલીય રંગદ્રવ્યની સરખામણીમાં બેક્ટેરિયા વધુ ઝડપથી અને વધુ તીવ્રતાથી રંગાય છે, અને સામાન્ય બેક્ટેરિયોલોજિકલ સ્મિયરમાં જાણીતા ઘેરા વાદળી દંડાકાર અને ગોળાકાર બેક્ટેરિયા દેખાય છે. અભિરંજનનો સમય સામાન્ય રીતે એકથી ત્રણ મિનિટ હોય છે, ત્યારબાદ પાણીથી ધોવામાં આવે છે.

તેનો પરંપરાગત ઉપયોગ લોફ્લર સીરમ માધ્યમ પર ઉગાડેલા Corynebacterium diphtheriae માટે થાય છે: પાતળા, ઘણી વાર ગદાકાર દંડાકાર બેક્ટેરિયા, જેમાં સંગ્રહિત પોલીફોસ્ફેટના મેટાક્રોમેટિક Babes-Ernst કણિકાઓ પ્રબળ રીતે રંગાય છે. માધ્યમ અને અભિરંજકની આ જોડી ઐતિહાસિક છે; બંનેનો શ્રેય એક જ બેક્ટેરિયાવિજ્ઞાનીને આપવામાં આવે છે, અને કણિકાઓનો સ્પષ્ટ રંગભેદ નિદાન માટેનો લાભ છે. ડિફ્થેરિયા સંબંધિત કાર્ય ઉપરાંત, આ અભિરંજક કલ્ચરમાંથી બનાવેલા સ્મિયર માટે સામાન્ય બેક્ટેરિયોલોજિકલ અભિરંજક તરીકે, ક્લિનિકલ સ્મિયરમાં Neisseriaના આકારવિજ્ઞાન માટે, અને જ્યાં ગ્રામ અભિરંજન જરૂરી ન હોય પરંતુ સાદું જલીય બ્લૂ બહુ ઝાંખું પડે ત્યાં વપરાય છે. તે એકરંગી અભિરંજક છે. દરેક અમ્લીય રચના વાદળીની કોઈ ને કોઈ છટા ધારણ કરે છે. જ્યારે પ્રોટોકોલમાં રંગ દ્વારા ભેદ પાડવો જરૂરી હોય, ત્યારે માત્ર ક્ષાર તે આપી શકતો નથી.

એક વ્યવહારુ સાવચેતી: ક્ષારીય રંગદ્રવ્ય દ્રાવણો સંગ્રહ દરમિયાન અને કાર્બન ડાયોક્સાઇડ શોષવાથી બગડે છે અને તેમાં અવક્ષેપ બને છે. પ્રયોગશાળાઓ કાં તો મર્યાદિત માત્રામાં દ્રાવણ બનાવે છે, અથવા કેટલોગમાંનું દ્રાવણ ખરીદી તેની સંગ્રહ અવધિનું પાલન કરે છે; દરેક સ્લાઇડ પર કાંપ છોડતી જૂની બોટલને ખેંચીને ચલાવતી નથી.

પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ: એક નામ, અનેક રંગદ્રવ્યો

પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ એ જ રંગદ્રવ્યથી શરૂ થાય છે, પરંતુ ક્ષારીય માધ્યમમાં તેનું નિયંત્રિત ઓક્સિડેશન કરવામાં આવે છે. ઐતિહાસિક રીતે આ પ્રક્રિયાને પરિપક્વ કરવું અથવા પોલીક્રોમિંગ કહેવામાં આવતી હતી. ક્ષારીય માધ્યમમાં સમયાંતરે થતો ફેરફાર, કાર્બોનેટ સાથે ગરમ કરવું, અથવા ડાઇક્રોમેટ જેવા કારકો દ્વારા ઓક્સિડેશન કરવું—આ પ્રક્રિયાઓ ડાઇમિથાઇલએમિનો અવેજી સમૂહોમાંથી મિથાઇલ સમૂહોને તબક્કાવાર દૂર કરે છે. ઉત્પાદન એક મિશ્રણ હોય છે: બાકી રહેલું મેથિલીન બ્લૂ, azure B (એક મિથાઇલ સમૂહ દૂર થયેલો), azure A અને azure C (વધુ ડીમિથાઇલેશન), થાયોનિન (સંપૂર્ણપણે ડીમિથાઇલેટ થયેલું), અને મેથિલીન વાયોલેટ વર્ગના ઓક્સિડેશનજન્ય આડપેદાશો. દરેક ઘટકની પોતાની રંગછટા અને પેશી પ્રત્યેનું આકર્ષણ હોય છે. તેથી મિશ્રણ મેટાક્રોમેટિક રીતે રંગે છે: કેન્દ્રકો, કણિકાઓ, મ્યુસિન અને કોમલાસ્થિ દરેક વાદળીથી લાલ-જાંબલી સુધીની અલગ રંગછટાઓ ધારણ કરે છે.

આ જ રસાયણશાસ્ત્ર જાણીતા રક્ત અભિરંજકો પાછળ કાર્ય કરે છે. શરૂઆતના સંશોધકોએ જોયું કે ક્ષારીકૃત મેથિલીન બ્લૂ મલેરિયા પરોપજીવીના કેન્દ્રકોને જાંબલી છટાઓમાં રંગતું હતું, પરંતુ તેમના જલીય પરિપક્વ દ્રાવણો અસ્થિર હતા અને થોડા દિવસોમાં અવક્ષેપ બનતો હતો. જાંબલી રક્ત અભિરંજકની શોધ કેવી રીતે થઈ તેની સમીક્ષા દર્શાવે છે કે Malachowski અને Romanowskyએ 1891માં સ્વતંત્ર રીતે આ અસરનો ઉપયોગ કેવી રીતે કર્યો, રંગદ્રવ્યના અવક્ષેપને સ્થિર કરવા અને ગરમી વિના સ્મિયર સ્તરોને સ્થિર કરવા મેથેનોલ કેવી રીતે રજૂ થયું, અને પછી Giemsaએ ગ્લિસરોલ દ્વારા સ્થિરીકરણ સાથે માપેલી માત્રાના azure B અને ઇઓસિનને આધારે મિશ્રણનું માનકીકરણ કેવી રીતે કર્યું. આધુનિક Giemsa-પ્રકારના અભિરંજકો સીધા પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ અને ઇઓસિનના સંયોજનમાંથી વિકસ્યા છે; આ સંયોજન Romanowsky અસર પેદા કરે છે. ઇઓસિન સાથેની જોડી અને azure B ઘટકની વિગત માટે Romanowsky-પ્રકારના અભિરંજકો અને azure B તથા ઇઓસિન વચ્ચેની ક્રિયા જુઓ.

તે મિશ્રણ હોવાથી, પોલીક્રોમ મેથિલીન બ્લૂ સ્વભાવતઃ આ ત્રણમાં સૌથી ઓછું માનકીકૃત છે. તેની રંગછટાઓનું ચોક્કસ સંતુલન ઓક્સિડેશનની પદ્ધતિ અને તેની માત્રા પર આધાર રાખે છે. તેથી જ પેશીવિજ્ઞાનના પુરવઠાકારો તેને જૂનું થયેલું લોફ્લરનું દ્રાવણ ગણવાને બદલે પોતાની કાર્યક્ષમતા ચકાસણી ધરાવતા અલગ ઉત્પાદન તરીકે વેચે છે. તેના સામાન્ય ઉપયોગોમાં માસ્ટ કોષોની કણિકાઓ, મ્યુસિન અને કોમલાસ્થિનું મેટાક્રોમેટિક પ્રદર્શન, પ્લાઝ્મા કોષોની વિગતો, અને Goodpasture-પ્રકારની પોલીક્રોમ પદ્ધતિઓ દ્વારા પેશીના વિભાગોમાં Helicobacter pylori દર્શાવવાનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે હેતુ રંગ દ્વારા ભેદ પાડવાનો હોય ત્યારે તે યોગ્ય પસંદગી છે, અને જ્યારે પ્રોટોકોલમાં બેક્ટેરિયાની સ્પષ્ટ એકરંગી આકૃતિ અપેક્ષિત હોય ત્યારે તે ખોટી પસંદગી છે.

બનાવટ અને હેતુની સરખામણી

આ કોષ્ટકને નિર્ણય લેવાની પ્રક્રિયા તરીકે વાંચો. જો નમૂનો બહુ ઝાંખો રંગાતો હોય, તો pHનો ખ્યાલ બદલો અને લોફ્લરનું દ્રાવણ પસંદ કરો. જો બધું રંગાતું હોય પણ કોઈ રચના અલગ ન દેખાતી હોય, તો રંગદ્રવ્યનો ખ્યાલ બદલો અને પોલીક્રોમ પસંદ કરો. જો લોફ્લરથી રંગાયેલા સ્મિયરમાં કણિકાઓ સુંદર દેખાતી હોય, પરંતુ સુપરવાઇઝર પૂછે કે કેન્દ્રક અને કોષદ્રવ્ય એક જ વાદળી રંગમાં કેમ છે, તો જવાબ એ છે કે કોઈ પણ ક્ષારીય એકરંગી અભિરંજક તે બંનેને જુદા રંગ આપી શકતો નથી. તે જરૂરિયાત પોલીક્રોમ વર્ગ અને તેના રક્ત અભિરંજક વ્યુત્પન્નો દ્વારા પૂરી થાય છે.

સામાન્ય ગેરસમજો ટાળવી

મોટાભાગની ગૂંચવણ બે ભૂલોથી થાય છે. પહેલી એ છે કે લોફ્લરના દ્રાવણને સાદા મેથિલીન બ્લૂના સ્થાને વાપરી શકાય એવું માનવું, કારણ કે બોટલમાં બંને વાદળી દેખાય છે. બંને pH અને તીવ્રતામાં જુદા છે, અને જ્યાં લોફ્લરનું દ્રાવણ નિર્દિષ્ટ હોય ત્યાં તટસ્થ રંગદ્રવ્ય વાપરવાથી એ જ કણિકાઓનો રંગભેદ ખોવાઈ જાય છે જેના આધારે પ્રોટોકોલ બનાવવામાં આવ્યો હતો. બીજી ભૂલ કોઈ પણ જૂના અથવા આકસ્મિક રીતે સમય જતાં બદલાયેલા ક્ષારીય બ્લૂને પોલીક્રોમ ગણવાની છે. અનિયંત્રિત રીતે જૂનું થવાથી અજ્ઞાત સાંદ્રતાવાળું અજ્ઞાત મિશ્રણ બને છે, જ્યારે સાચાં પોલીક્રોમ દ્રાવણો નિર્ધારિત ઓક્સિડેશન પદ્ધતિઓથી તૈયાર થાય છે અને રક્ત અભિરંજક પરંપરામાં તેમને ઇઓસિનની માપેલી માત્રા સાથે ભેળવવામાં આવે છે. અહીં ઇતિહાસ માર્ગદર્શક છે: 1890ના દાયકાના અસ્થિર જલીય પરિપક્વ દ્રાવણોની જગ્યાએ મેથેનોલ વડે સ્થિર કરેલી બનાવટો આવી, કારણ કે અનિયંત્રિત મિશ્રણોને ફરીથી એ જ રીતે બનાવી શકાતાં નહોતાં. અજ્ઞાત ઉંમરની બોટલમાંથી નિદાન માટેની સ્લાઇડ રંગતાં પહેલાં આ પાઠ યાદ રાખવા જેવો છે.

નામની ચોકસાઈ આ ગૂંચવણનો ઉકેલ પૂર્ણ કરે છે. રંગ પરથી અનુમાન કરવાને બદલે લેબલ પર કેટલોગ વસ્તુ (જલીય, લોફ્લર કે પોલીક્રોમ), રંગદ્રવ્યનું પ્રમાણ અને નિર્ધારિત ઉપયોગ ખાતરીથી તપાસો. આ ત્રણ બનાવટો એક જ મૂળ રંગદાયક અણુસમૂહમાંથી આવે છે. તેમનો હેતુ એકસરખો નથી.