Éifeachtaí miteacoindreacha an ghoirm meitiléine a thomhas: ocsaigin, ATP, agus poitéinseal scannáin

Cuir i gcás go gcuireann saotharlann gorm meitiléine le miteacoindrí a bhfuil lagú riospráide orthu agus go bhfeiceann sí méadú ar ídiú ocsaigine. Is é an abairt nádúrtha le scríobh ná gur athbhunaigh an ruaim feidhm na miteacoindrí. D’fhéadfadh an abairt sin a bheith mícheart. Is trí choincheap ar leith iad flosc ocsaigine, sintéis ATP, agus poitéinseal scannáin. Baineann siad leis an orgánaid chéanna mar a bhaineann cúltaca, sioncrónú, agus comhroinnt leis an bhfillteán néil céanna: tá siad gaolmhar, ach rialaítear iad le rialacha éagsúla. Má chuirtear ceann acu in áit cinn eile, teipeann ar an léirmhíniú, fiú nuair atá gach tomhas ceart go teicniúil.

Is dócha go dtarlóidh an mearbhall sin leis an ngorm meitiléine toisc go nglacann sé páirt sa chóras a thomhaiseann sé. Is timthriallóir ocsaídiúcháin-laghdúcháin é a ghlacann le leictreoin in aghaidh srutha agus a thugann uaidh iad le sruth, caitiain lipeafileach a charnann i miteacoindrí fuinnmhithe, agus comhdhúil ghorm dhian a ionsúnn agus a astaíonn solas sna bandaí céanna le tóireadóirí coitianta. Ní féidir le léamh amháin an t-ualach sin a iompar. Is é an cur chuige iontaofa, a léirítear i staidéir mhiteacoindreacha Bhúdaipeist, flosc ocsaigine móide ráta sintéise ATP móide poitéinseal scannáin móide scaoileadh sárocsaíde hidrigine a thomhas, le rialuithe atá sonrach don ruaim ag gach céim.

Tomhaiseann riospraiméadracht flosc ocsaigine, ní aschur fuinnimh

Tuairiscíonn riospraiméadracht ardtaifigh, bíodh sé le Oroboros Oxygraph nó le hanailíseoir flosca seachcheallaigh Seahorse, rud amháin: cé chomh tapa agus atá ocsaigin á laghdú. Ní thuairiscíonn sí cé mhéad prótón a caidéalaíodh in aghaidh an leictreoin, cé mhéad den ghrádán a caomhnaíodh, ná ar úsáid sintáis ATP é.

Tá tábhacht leis an téarmaíocht. I miteacoindrí leithlisithe, tugann foshraith gan ADP riospráid sceite, tugann foshraith le ADP ag tiúchan sáithithe toilleadh fosfaraithe ocsaídiúcháin, agus tugann toirtmheascadh le díchúplóir uas-toilleadh aistrithe leictreon. I gcealla slána, is iad na coibhéisí Seahorse ná riospráid bhunlíne, riospráid atá nasctha le ATP agus íogair d’olagaimeicin, sceitheadh prótón, uasriospráid arna sainiú le FCCP, agus ídiú ocsaigine neamh-mhiteacoindreach atá frithsheasmhach in aghaidh róitéanóin móide antaimicin. Má thugtar Staid 3 agus Staid 4 ar aschuir Seahorse, cuirtear cruinneas ina leith nach dtacaíonn an t-ullmhóid leis, mar a léiríonn creat Mito Stress Test Agilent.

Briseann gorm meitiléine an nasc iomasach idir níos mó ocsaigine agus níos mó fuinnimh. I miteacoindrí leithlisithe ó inchinn muice guine, mhéadaigh 100 nM go 1 uM den ruaim ídiú ocsaigine ag scíth le foshraitheanna glútamáite móide maláite, sucaináite, agus alfa-gliocrófhosfáite, le méadú thart ar 64 faoin gcéad ar alfa-gliocrófhosfáit, ach d’fhan riospráid arna spreagadh le ADP i miteacoindrí sláintiúla gan athrú go bunúsach, de réir an staidéir ar mhiteacoindrí leithlisithe inchinne. Toisc gur mhéadaigh an sceitheadh agus gur fhan an flosc arna spreagadh le ADP cothrom, titeann an cóimheas ríofa rialaithe riospráide. Ní chiallaíonn an titim sin gur rinne an ruaim damáiste do na miteacoindrí. Ciallaíonn sí gur chuir an ruaim timthriall ocsaídiúcháin-laghdúcháin a ídíonn ocsaigin sa bhreis ar ghnáthriospráid. Má thuairiscíonn measúnacht ídithe ocsaigine le gorm meitiléine an méadú amháin, tá fíorcheimic tomhaiste aici ach níl aon rud ráite aici faoi chaomhnú fuinnimh.

Léiríonn na turgnaimh athbhunaithe an bhearna chéanna ar scála níos mó. Agus Coimpléasc I bactha, d’athbhunaigh flosc ocsaigine thart ar thrí oiread agus níor athbhunaigh sintéis ATP ach thart ar 1.5 oiread. Shroich níos mó ocsaigine an leictreoid. Chuaigh níos lú di chun ATP a ghiniúint. Teastaíonn taobh ATP den chuntas le haon mhaíomh go bhfuil fosfarú ocsaídiúcháin feabhsaithe, agus b’fhearr é a chur in iúl mar chóimheas ATP in aghaidh ocsaigine agus an coinbhinsiún don ainmneoir luaite.

Tomhaiseann measúnachtaí ATP ráta sintéise, nach féidir méid ATP a chur ina áit

Freagraíonn measúnacht ATP ceist eile: cé mhéad ATP a ghintear in aghaidh an aonaid ama. Tugann léamh cinéiteach ráta, cibé acu lonracht lúicifaráise ciaróige tine a rianaítear thar nóiméid nó measúnacht chúpláilte heicsicíonáise móide díhidrigionáise glúcóis-6-fosfáite a léitear ag 340 nm atá i gceist. Tugann tomhas aonair de ATP iomlán ag críochphointe méid ATP, a léiríonn sintéis lúide ídiú agus nach n-insíonn mórán faoi fhosfarú ocsaídiúcháin leis féin.

D’úsáid grúpa Bhúdaipeist an modh einsímeach cúpláilte agus cíonáis aidinealáite faoi chois, agus fuair siad amach gur mhéadaigh gorm meitiléine ag 1 go 2 uM táirgeadh ATP go measartha ach go suntasach i miteacoindrí ar cuireadh róitéanón nó antaimicin orthu. Is fíor-athbhunú é sin, agus is athbhunú páirteach é. Tháinig an staidéar ar thocsaineacht TEGDMA ar fhreagra den chineál céanna i samhail eile: laghdaigh 5 mM den mhonaiméir fiaclóireachta TEGDMA riospráid nasctha le Coimpléasc I go géar ó thart ar 286 go 28 aonad flosca, agus d’athbhunaigh 2 uM den ruaim í go thart ar 86.

Tá dhá rialú fíor-riachtanach le comhdhúil dhaite ocsaídiúcháin-laghdúcháin. Ar an gcéad dul síos, bain úsáid as olagaimeicin chun a fháil amach cé mhéad den tsintéis ATP a thomhaistear atá ag brath ar shintáis ATP. Ar an dara dul síos, déan tástáil aisghabhála ar ATP breisithe i gcóras saor ó chealla, le méid aitheanta ATP móide an t-imoibrí iomlán móide na tiúchana beachta ruaime a úsáideadh, agus 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, agus 2 uM ar a laghad san áireamh. Is féidir leis an ruaim solas astaithe a ionsú, an einsím tuairisceora a chosc, nó ceimic ocsaídiúcháin-laghdúcháin an imoibrí a athrú, agus molann treoir ghinearálta maidir le measúnachtaí lúicifaráise frithscagthástálacha bithcheimiceacha don chineál seo trasnaíochta go díreach. Ná glac leis go bhfuil 1 uM saor ó dhéantáin tomhais toisc go mbíonn múchadh níos measa de ghnáth ag tiúchana níos airde.

Tomhaiseann tóireadóirí poitéinsil scannáin dáileadh ruaime, ní flosc

Is caitiain atá in ann dul tríd an scannán iad Safranin O, TMRM agus TMRE, ródamaín 123, agus JC-1. Carnann siad sa mhaitrís atá luchtaithe go diúltach de réir cothromaíochta leictriceimicí, agus mar sin tuairiscíonn fluaraiseacht an tsampla ina iomláine an poitéinseal go hindíreach trí shuíomh an tóireadóra. Ní thomhaiseann aon cheann acu ATP ná flosc leictreon.

Tá ullmhóid is fearr a oireann do gach tóireadóir. Oireann Safranin O do mhiteacoindrí leithlisithe agus do chealla tréscaoilte, ag thart ar 2 uM de ghnáth le sceitheadh gar do 495 nm agus astú gar do 585 nm, agus é ag feidhmiú i réimeas múchta ina n-athraíonn iontógáil fluaraiseacht an tsampla ina iomláine. Oireann TMRM agus TMRE do chealla slána le luchtú íseal nanamhólach i mód gan mhúchadh, ina scaoileann dípholarú an ruaim agus ina dtiteann fluaraiseacht mhiteacoindreach; ag luchtú ard, féadann treo an chomhartha iompú de bharr féinmhúchta. Tugann JC-1 cóimheas áisiúil glas le dearg ach braitheann sé ar luchtú agus ar mhais mhiteacoindreach, rud a fhágann nach bhfuil sé chomh maith céanna d’obair chainníochtúil le TMRM atá rialaithe go cúramach. Tá achoimre ar na comhbhabhtálacha seo in athbhreithniú a úsáidtear go forleathan ar thóireadóirí poitéinsil scannáin mhiteacoindrigh.

Cuireann gorm meitiléine isteach go hoptúil ag na tiúchana oibre féin. Forluíonn a bhandaí ionsúcháin gar do 600 go 665 nm le hastú dearg na dtóireadóirí, agus mar sin tá éifeachtaí scagaire inmheánaigh, múchadh, agus ionsú solais sceite go léir inchreidte. Is dara caitiain lipeafileach í an ruaim freisin, a n-athraíonn a dáileadh féin leis an bpoitéinseal atá á thomhas. Is é an chosaint ná tomhais iomarcacha móide samplaí bána: an tóireadóir leis féin, an ruaim léi féin, an tóireadóir móide gach tiúchan ruaime, dípholarú iomlán le FCCP mar thagairt nialais, agus go hidéalach dara tóireadóir atá éagsúil ó thaobh optúil de. Leag an staidéar ar sheachbhóthar Choimpléasc III an fasach sin trí athbhunú an phoitéinsil scannáin a athdhéanamh le Safranin O agus TMRM araon tar éis cosc le hanta imicin agus miocsaiteasól, agus an t-athbhunú cáilíochtúil céanna a fháil. Is leid é tuairisceoir optúil amháin. Is fianaise iad dhá thuairisceoir neamhspleácha.

Trí ullmhóid, trí cheist éagsúla

Ní socruithe íogaireachta inmhalartaithe ar aon mheasúnacht amháin iad miteacoindrí leithlisithe, cealla tréscaoilte, agus cealla slána. Is coincheapa éagsúla iad a bhfuil prionsabail oibríochta éagsúla acu.

Caomhnaíonn miteacoindrí leithlisithe an slabhra iompair leictreon, an scannán inmheánach, agus innealra na maitríse agus an scannán plasma, an cíteasol, agus ailtireacht an líonra á mbaint. Is é an bhaint sin an cuspóir: sainítear foshraitheanna, ADP, coscairí, agus tiúchana ruaime go beacht, ionas gur féidir conair a shannadh. Is é an costas ná cailliúint an tsoláthair nádúrtha foshraithe, na comharthaíochta, agus an éilimh.

Coinníonn cealla tréscaoilte na miteacoindrí laistigh de chuid mhór dá n-ailtireacht cheallach agus ligeann siad foshraitheanna eisigineacha agus ADP tríd an scannán plasma oscailte. Is iad an uirlis cheart chun fabht i gconair foshraithe a shannadh laistigh de chomhthéacs ceallach. Déanann ró-thréscaoilteacht damáiste don scannán seachtrach, agus nitear rialú cíteasolach amach.

Caomhnaíonn cealla slána gach rud: bacainn an scannáin plasma, oibreáin laghdúcháin chíteasolacha, iompar foshraitheanna ingineacha, an líonra miteacoindreach, agus éileamh ATP. Is iad is gaire don fhiseolaíocht agus is faide ón meicníocht, toisc go múnlaíonn iontógáil, laghdú, agus forghabháil na ruaime go léir an nochtadh éifeachtach miteacoindreach.

D’úsáid staidéar TEGDMA na trí leibhéal d’aon ghnó: miteacoindrí leithlisithe inchinne chun ocsaídiú agus poitéinseal a athbhunú leis an ruaim, gaschealla tréscaoilte laín fiacla chun suíomh an locht a aimsiú go príomha in ocsaídiú foshraithe atá nasctha le Coimpléasc I, agus gaschealla slána chun glanéifeacht fhiseolaíoch 2 uM den ruaim ar ídiú ocsaigine a bhí faoi chois a mheas. Do léitheoirí atá ag déanamh comparáid idir léamha miteacoindreacha thar ullmhóidí éagsúla, tugann an t-alt míniúcháin gaolmhar faoi conas a bhogann gorm meitiléine leictreoin tríd an slabhra riospráide cúlra na conaire, agus clúdaíonn an treoir maidir le staidéir riospráide ar ghorm meitiléine a léamh loighic na dáileoige agus na gcoscairí.

Rialuithe a éilíonn ruaim atá gníomhach ó thaobh ocsaídiúcháin-laghdúcháin de

Teastaíonn liosta rialuithe níos faide ó thimthriallóir ocsaídiúcháin-laghdúcháin ná ó ghnáthchoscóir, toisc gur féidir le ceimic na ruaime amháin aithris a dhéanamh ar an mbitheolaíocht.

Maidir le riospraiméadracht, úsáid seomra ina bhfuil maolán amháin chun sruth tomhais a mheas, seomra ina bhfuil maolán móide ruaim gan ábhar bitheolaíoch, ruaim móide aon oibreán laghdúcháin seachcheallach atá sa mheasúnacht, agus róitéanón móide antaimicin ag an deireadh chun ídiú ocsaigine neamh-mhiteacoindreach a shainiú i gcealla slána. Tabhair faoi deara go n-athocsaídítear ruaim laghdaithe trí leictreoin a aistriú chuig ocsaigin chun sárocsaíd hidrigine a chruthú, agus mar sin déanann sampla bán ina bhfuil ruaim amháin gan deontóir leictreon tearcmheas ar an linn ídithe ocsaigine saor ó chealla a thagann chun cinn nuair a bhíonn NADH nó NADPH ar fáil.

Maidir le sárocsaíd hidrigine, tabhair tosaíocht do Amplex UltraRed calabraithe móide sárocsaíodáis raidise capaill thar ruaimeanna neamhroghnacha DCFDA, fíoraigh le cataláis, agus tástáil spleáchas ar shoilsiú, ós fóta-íogróir í an ruaim. Fuair an staidéar ar mhiteacoindrí inchinne amach gur mhéadaigh an t-ualach sárocsaíde níos mó ná ceithre oiread ag 100 nM den ruaim amháin agus gur mhoilligh an díothú, agus an tsárocsaíd á foirmiú go díreach ag ruaim laghdaithe gan idirmheánach sár-ocsaíde. Baineann sonraí faoi roghnú tóireadóirí agus rialuithe solais leis an alt gaolmhar faoi speicis imoibríocha ocsaigine a thomhas i dturgnaimh ruaime, agus pléitear an cheist níos leithne faoi cathain a fheidhmíonn sárocsaíd mar chomhartha seachas mar ualach in éineacht le cothromaíocht cheallach ocsaídiúcháin-laghdúcháin agus maímh faoi fhrithocsaídeoirí.

Maidir le maímh faoi chonairí, tástáil an dá shuíomh coscóra i gCoimpléasc III: antaimicin A ag suíomh Qi agus miocsaiteasól ag suíomh Qo, móide críochphointe Choimpléasc IV le ciainíd. Thuairiscigh staidéar níos luaithe ar inchinn luiche gur athbhunaigh an ruaim riospráid a bhí bactha le róitéanón ach nár athbhunaigh sí riospráid a bhí bactha le hanta imicin, ach fuair an staidéar níos déanaí ar thrí speiceas athbhunú páirteach leis an dá choscóir agus fianaise ar laghdú díreach cíteacróim c. Meas go bhfuil an seachbhóthar comhoiriúnach leis na sonraí níos nuaí seachas a bheith socraithe go cinntitheach, ós rud é go n-athraíonn tiúchan na ruaime, suíomh an choscóra, staid na foshraithe, agus dáileadh na ruaime go léir an bealach a bhreathnaítear.

Maitrís roghnúcháin measúnachta

Úsáid an tábla seo chun an tomhas a roghnú de réir na ceiste, ní an ceist de réir an tomhais.

Chun an maíomh íosta áititheach a dhéanamh, déantar tástáil ar na tiúchana céanna ruaime, 100 nM, 300 nM, 1 uM, agus 2 uM, maidir le flosc ocsaigine faoi dhálaí sceite, ADP, olagaimeicine, agus díchúplóra, ráta sintéise ATP, poitéinseal scannáin le dhá thóireadóir de rogha, agus scaoileadh calabraithe sárocsaíde le cataláis agus rialuithe saor ó chealla. Tuairiscigh an tacar nasctha: flosc ocsaigine móide ráta ATP móide ATP in aghaidh ocsaigine móide poitéinseal móide sárocsaíd. Is tomhas atá ag lorg brí é aon cheann de na huimhreacha sin leis féin.