Gorm meitiléine chun DNA agus RNA a dhathú: feidhmeanna i nglóthacha agus ar scannáin

Ritheann mac léinn glóthach agaróis, dathaíonn sé í le gorm meitiléine, agus ní fheiceann sé rud ar bith san áit a raibh súil aige le banda geal. Sa spás oibre in aice leis, dathaíonn taighdeoir iardhochtúireachta scannán Northern leis an mbuidéal gorm céanna agus faigheann sé bandaí ribeasómacha géara i dtrí nóiméad. Tagann an mac léinn ar an tuairim gur theip ar an nglóthach. Níor theip uirthi. Bhí an dá thasc éagsúil, agus tugann an dathán céanna freagra orthu le híogaireacht éagsúil, cúlra éagsúil agus rialacha éagsúla maidir leis na céimeanna ina dhiaidh.

Tá an cheimic chéanna ag dathú DNA agus dathú RNA le gorm meitiléine, ach tá cuspóirí éagsúla acu. I nglóthach, léiríonn an dathán an méid aigéid núicléasaigh atá laistigh de mhaitrís phóiriúil. Ar scannán, léiríonn sé ar éirigh leis an aistriú agus ar luchtaíodh na lánaí go cothrom. Nuair atá an difríocht sin soiléir, bíonn ciall leis na prótacail, na teorainneacha braite agus na teorainneacha comhoiriúnachta.

An freagra gairid

Is dathán caitiúnach plánach é gorm meitiléine a cheanglaíonn le haigéid núicléasacha go neamhchomhfhiúsach agus go hinchúlaithe, trí mheascán de mhealladh leictreastatach chuig fosfáit, idirshuíomh idir bunphéirí agus ceangal sa mhionchlais. Is í an inchúlaitheacht sin an bunphointe. Is féidir bandaí a dhathú agus a fheiceáil faoi sholas infheicthe, iad a dhoiciméadú, agus ansin an dath a bhaint nó iad a ghlanadh le haghaidh clónála, hibridithe nó athphróbála.

Chun DNA déshnáitheach a dhathú i nglóthach agaróis le gorm meitiléine, is é an t-oideas tapa caighdeánach ná 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) in uisce, thart ar 15 nóiméad dathaithe agus thart ar 15 nóiméad bainte datha in uisce, agus breathnú air ar bhosca solais bháin. I gcás scannán, is é an t-oideas clasaiceach do bhlot Northern ná 0.02 go 0.04 percent den dathán in aicéatáit sóidiam ag pH gar do 5.2, roinnt nóiméad dathaithe tar éis aistrithe agus doghluaisithe, ansin sruthlú le huisce agus baint iomlán an datha roimh hibridiú. Tá an íogaireacht measartha: na deicheanna go dtí na céadta nanagram in aghaidh an bhanda glóthaí faoi dhálaí maithe, agus luann treoracha coimeádacha 0.5 go 1 microgram. Tá sin roinnt oird mhéide os cionn bhróimíd eitidiam agus datháin SYBR. Ar scannáin, níl aon teorainn braite aonair úsáideach do thras-scríbhinní, toisc gur RNA ribeasómach flúirseach agus an t-ábhar iomlán luchtaithe is mó a léiríonn an dathán. Ná cuir tuaslagán forlíonta miondíola in ionad an datháin i gceachtar oideas. Glacann modhanna bailíochtaithe leis go n-úsáidtear dathán de ghrád anailíseach, maoláin shainithe agus láimhseáil saor ó RNase nuair atá RNA i gceist.

Conas a oibríonn an ceangal, agus cá mbíonn sé míthreorach

Tá trí chuid sa tsamhail úsáideach. Ar an gcéad dul síos, tarraingítear an córas fáinní atá luchtaithe go deimhneach chuig an gcnámh droma fosfáite atá luchtaithe go diúltach. Léiríonn obair speictreascópach go bhfuil an chomhpháirt leictreastatach seo ceannasach ag tiúchan íseal salainn, agus coinníonn samhaltú agus dinimic mhóilíneach idirshuíomh agus ceangal sa mhionchlais mar mhodhanna cobhsaí do DNA déshnáitheach, mar a achoimrítear i staidéar speictreascópach ar cheangal goirm meitiléine le DNA. Ar an dara dul síos, tá rogha áirithe ann do GC: tugann samhaltú tús áite do chéimeanna CpG agus GpC, agus tuairiscíonn turgnaimh ceangal fabhrach le déphléacsanna saibhir in GC in obair ar roghanna idirshuímh goirm meitiléine, ach ceanglaíonn déphléacsanna AT freisin. Ní bhaineann dathú gnáthaimh go sonrach le seicheamh ar leith. Ar an tríú dul síos, ceanglaíonn DNA aonshnáitheach agus RNA den chuid is mó trí idirghníomhaíochtaí leictreastatacha agus cruachadh le bunanna inrochtana agus réigiúin déphléacsacha. Sin an fáth a n-athraíonn neart an dathaithe de réir faid, seichimh agus struchtúir thánaistigh.

Tagann dhá iarmhairt as sin. Toisc go bhfuil an ceangal neamhchomhfhiúsach, nitear an dathán amach. Céimníonn bandaí polaiacrailimíde go tapa mura ndéantar iad a fhosú d'aon ghnó, agus tá leagan sonrach ann le haghaidh fosú buan go díreach toisc gur dathú sealadach é an gnáthdhathú, mar a chuireann Soto agus Draper síos air do ghlóthacha PAGE. Toisc gur fótaisensiteoir é an dathán, is féidir le soilsiú geal fada ar DNA dathaithe i láthair ocsaigine guainín a ocsaídiú agus, faoi dheireadh, bristeacha aonshnáitheacha a dhéanamh. Déantar cur síos mionsonraithe ar an meicníocht sin in obair ar ocsaídiú guainín arna íogrú ag gorm meitiléine. Seachnaíonn breathnú gairid faoi sholas bán an damáiste UV aitheanta a bhaineann le gnáthshreafaí oibre bróimíde eitidiam, agus is fíorbhuntáiste é sin d'aisghabháil ullmhúcháin. Tá solas infheicthe níos séimhe, ach níl sé neamhdhíobhálach. Coinnigh an soilsiú gairid nuair atá an DNA le clónáil. Chun an fhótaiceimic níos leithne taobh thiar den rabhadh sin a thuiscint, féach an dá chonair i bhfótaiceimic goirm meitiléine. Chun an péire ocsaídiúcháin-laghdúcháin agus na staideanna luchta a mhíníonn cén fáth a gceanglaíonn an fhoirm ocsaídithe agus nach gceanglaíonn an fhoirm laghdaithe a thuiscint, féach ceimic struchtúr agus airíonna goirm meitiléine.

Tasc a haon: dathú laistigh de ghlóthacha

Freagraíonn dathú glóthaí ceist amháin: an bhfuil dóthain aigéid núicléasaigh sa bhanda seo chun é a fheiceáil leis an tsúil? Is é DNA déshnáitheach in agarós an cás is fearr a bhfuil cur síos déanta air. Rinne bunmhodh dathaithe glóthaí le gorm meitiléine le Flores agus a chomhghleacaithe an prótacal tapa 0.02 percent a bhailíochtú ar agarós 1 percent agus léirigh sé aisghabháil agus clónáil rathúil ina dhiaidh. Tá an prótacal céanna ón soláthraí ar leathanach táirge goirm meitiléine IBI Scientific, a liostaíonn an t-oideas scannáin 0.04 percent agus an leagan tapa do ghlóthacha taobh le taobh.

Sreabhadh oibre praiticiúil:

1. Rith an ghlóthach mar is gnách. Dathaigh í tar éis leictreafóiréise, ní lena linn, mura bhfuil an t-aistriú nó an taifeach bailíochtaithe do mhodh modhnaithe.
2. Tum í i ngorm meitiléine 0.02 percent w/v in uisce driogtha, agus corraigh go réidh í, ar feadh thart ar 15 nóiméad.
3. Bain an dath le roinnt athruithe uisce, ar feadh thart ar 15 nóiméad san iomlán, go dtí go laghdaíonn cúlra na maitríse agus go seasann na bandaí amach.
4. Tóg grianghraf go pras ar shoilsitheoir solais bháin.

Iompraíonn agarós agus polaiacrailimíd iad féin ar bhealaí éagsúla. Coinníonn agarós dathán sa mhaitrís, agus mar sin is í baint an datha an chéim mhall. Dathaítear glóthacha tanaí polaiacrailimíde go tapa ach cailleann siad an dathán go tapa freisin, rud a chabhraíonn le gearradh amach ullmhúcháin ach a dhéanann dochar do thaifid chartlainne. Is féidir olaganúicléatídí sintéiseacha i bpolaiacrailimíd a aimsiú leis an oideas céanna 0.02 percent i 20 go 30 nóiméad, le níocháin uisce arís agus arís eile, de réir modhanna seanbhunaithe PAGE de chineál Current Protocols. Tuairiscíodh leaganacha an-chaolaithe gar do 0.0002 percent in TBE caolaithe d'olaganúicléatídí ullmhúcháin thar roinnt uaireanta, ach tá an bonn fianaise níos laige.

Tá an difríocht idir DNA agus RNA tábhachtach. Tugann DNA déshnáitheach an ceangal struchtúrtha is láidre. Dathaítear RNA agus DNA aonshnáitheach, ach ar bhealach níos laige agus níos lú intuartha. I gcás glóthacha RNA agaróis le formaildéad, ní dhéanann formhór na saotharlann an dathú gorm sa ghlóthach: aistríonn siad an RNA chuig scannán ar dtús agus dathaíonn siad ansin é. Faigheann siad comhartha níos géire ar an scannán agus taifead luchtaithe in ionad comhartha lag sa ghlóthach.

Tasc a dó: dathú ar scannáin

Freagraíonn dathú scannáin ceist eile: ar éirigh leis an aistriú, agus an bhfuil na lánaí inchomparáide? Is é an feidhmchlár clasaiceach ná dathú inchúlaithe blota Northern le Herrin agus Schmidt: 0.04 percent den dathán i 50 mM d'aicéatáit sóidiam ag pH 5.0 ar feadh 2 go 3 nóiméad sa bhunleagan, agus sruthlú le huisce ina dhiaidh. Is féidir an dathán a bhaint le SDS caolaithe in SSPE roimh hibridiú.

Seo mar a dhéantar an leagan nua-aimseartha a úsáidtear go forleathan:

1. Aistrigh RNA nó DNA dínádúraithe chuig níolón nó nítriceallalós, ansin déan é a dhoghluaisi trí thrasnascadh UV nó trí bhácáil ionas nach gcaillfear an sampla le linn dathaithe.
2. Roghnach ach coitianta: fliuch an scannán in aigéad aicéiteach 5 percent ar feadh thart ar 15 nóiméad.
3. Dathaigh ar feadh 5 go 10 nóiméad i ngorm meitiléine 0.02 go 0.04 percent i 0.3 go 0.5 M d'aicéatáit sóidiam ag pH gar do 5.2.
4. Sruthlaigh agus bain an dath in uisce ar feadh 5 go 15 nóiméad, déan taifead, ansin bain an dathán iarmharach roimh hibridiú.

Is é níolón atá luchtaithe go deimhneach is mó a úsáidtear in obair Northern. Oibríonn nítriceallalós leis an sreabhadh oibre céanna d'aigéad aicéiteach agus aicéatáit freisin. Úsáidtear an íomhá chun an t-aistriú a dheimhniú, chun bandaí 28S agus 18S a chur i gcomparáid (nó 23S agus 16S i gcás RNA baictéarach), chun dréimirí agus caighdeáin a mharcáil, agus chun taifead garbh normalaithe a choinneáil don RNA iomlán. Déanann modhanna Northern foilsithe bandaí ribeasómacha dathaithe a chainníochtú chun luchtú a sheiceáil, lena n-áirítear obair san eolaíocht déiríochta a d'úsáid bandaí ribeasómacha dathaithe le gorm meitiléine le haghaidh normalaithe. Is féidir scannáin Southern a léirshamhlú ar an mbealach céanna, ach tá úsáid an datháin i bhfad níos seanbhunaithe chun luchtú agus aistriú Northern a sheiceáil. Déantar DNA Southern a dhínádúrú roimh aistriú, agus mar sin ní bhaineann figiúirí íogaireachta glóthaí leis go díreach.

Teorainneacha braite agus cúlra: cá mbíonn an gorm níos laige

Tá an chomparáid thíos garbh d'aon ghnó. Braitheann feidhmíocht an datháin ar chéatadán na glóthaí, leithead na mbandaí, an optaic agus cruinneas bhaint an datha. Caith le gach uimhir mar ord méide, ní mar shonraíocht.

Cinneann rialú cúlra an bhfuil an comhartha measartha inúsáidte. Tá dath an-dian ar dhathán saor, agus mar sin faightear codarsnacht trí dhathán neamhcheangailte a bhaint gan an dathán ceangailte a bhaint. Is annamh a mhéadaíonn dathán níos tiubhaithe an íogaireacht. Den chuid is mó, cuireann sé leis an am a theastaíonn chun an dath a bhaint. Rith sraith caolúcháin ar an nglóthach, ar an scannán agus leis an gceamara beacht atá in úsáid, agus ná húsáid ach an raon ina bhfanann an dlús comhtháite i gcomhréir leis an ionchur. Tacaíonn gorm meitiléine le normalú leathchainníochtúil ar luchtú. Ní measúnacht chainníochtúil le raon ard dinimiciúil é, toisc go n-athraíonn toilleadh an scannáin, éifeachtúlacht aistrithe, sáithiú agus baint datha ó lána go lána.

Teorainneacha comhoiriúnachta: cad a mhaireann tar éis dathaithe

Tá clónáil tar éis dathaithe le gorm léirithe. Ghearr Flores agus a chomhghleacaithe bandaí dathaithe amach as glóthacha agaróis, d'aisghabh siad an DNA, agus rinne siad ligiú agus claochlú leis. Thuairiscigh siad clónáil níos fearr ná tar éis bróimíd eitidiam le UV. Is dócha gur lú an fóta-dhamáiste ba chúis leis sin, seachas tairbhe ón dathán féin. Coinnigh an nochtadh do sholas bán gairid agus déan an DNA aisghafa a ghlanadh trí ghnáthnós imeachta eastósctha glóthaí.

Tá an fhianaise níos teoranta maidir le PCR agus seicheamhú. Ceanglaíonn dathán iarmharach le haigéid núicléasacha, mar sin bain an dath agus déan glanadh roimh chéimeanna einsímeacha. Táthar ag súil go n-oibreoidh DNA atá íonaithe i gceart ó ghlóthach ghorm, ach níl an fhulaingt do thabhairt an datháin ar aghaidh go díreach cainníochtaithe go maith thar pholaiméaráis agus ceimicí seicheamhaithe éagsúla. Ná glac leis go nglacfar leis.

Tá hibridiú blotaí comhoiriúnach nuair a chloítear go docht leis an ord: aistriú, doghluaisi, dathú, doiciméadú, baint datha, hibridiú. Sin é dearadh Herrin agus Schmidt. Is modh éagsúil é dathú roimh aistriú, nó gan an dath a bhaint, agus teastaíonn bailíochtú ar leith dó. Tar éis an dathán a bhaint, leanann baint caighdeánach na próibe agus athphróbáil ar aghaidh mar is gnách. Chun dathú ar leibhéal na cille leis an teaghlach céanna dathán a thuiscint, agus cén fáth nach mbaineann loighic na smearaidh fosaithe le modhanna do chealla beo, féach an t-atlas dathaithe micreascópachta.

Oibríonn gearradh amach bandaí le haghaidh agaróis ullmhúcháin agus olaganúicléatídí PAGE a aimsítear le gorm, ar choinníoll go seachnaítear an leagan fosaithe bhuain. Tá leictrealú tar éis baint datha inchreidte ó thaobh ceimice de do cheanglóir inchúlaithe, ach tá sonraí rialaithe ar thoradh atá sonrach do ghorm meitiléine gann. Bain na salainn nó déan deascadh tar éis elúcháin.

Teipeanna a tharlaíonn arís agus arís eile

De ghnáth, ciallaíonn bandaí laga glóthaí nach bhfuil dóthain maise ann do dhathán dathmhéadrach, go háirithe i gcás spriocanna gearra aonshnáitheacha nó RNA. Luchtaigh níos mó, úsáid dathán úr, sín an tréimhse dathaithe sula n-ardaíonn tú an tiúchan, agus stop baint an datha níos luaithe. De ghnáth, ciallaíonn glóthach atá go hiomlán gorm gan chodarsnacht gur dathadh an iomarca í nó nár athraíodh an t-uisce sách minic. Is toradh ceimiceach ionchais é céimniú bandaí PAGE, ní teip dathaithe. Tóg grianghraf go tapa. Tugann cúlra míchothrom ar scannán le fios go bhfuil fillteacha, boilgeoga, méarloirg, corraí míchothrom nó aistriú breac ann. Ná léirmhínigh é sin mar luchtú míchothrom gan rialú hibridithe. D'fhéadfadh patrún ribeasómach lag smeartha díghrádú a léiriú, ach d'fhéadfadh sé aistriú neamhiomlán, róbheagán RNA iomláin (bíonn roinnt micreagram go dtí na deicheanna micreagram i ngnáthlánaí), nó baint iomarcach datha a léiriú freisin. Léiríonn an dathán RNA ribeasómach flúirseach. Ní léiríonn sé tras-scríbhinn ar leith. Is í an phróib a dhéanann an obair sin.

Sábháilteacht agus láimhseáil gan áibhéil

Tá gorm meitiléine níos simplí a láimhseáil ná bróimíd eitidiam, ach níl sé neamhdhíobhálach. Aicmíonn bileog sonraí sábháilteachta reatha MilliporeSigma an dathán mar ghéarthocsaineacht bhéil, Catagóir 4, díobhálach má shlogtar é. Ní mór é a dhiúscairt trí bhealach dramhaíola ceadaithe de réir SDS Sigma-Aldrich do ghorm meitiléine. Tá rabhaidh níos láidre faoi ghéineatocsaineacht ag gabháil le bróimíd eitidiam, lena n-áirítear éifeachtaí amhrasta ar ghaiméití ina SDS Sigma-Aldrich do bhróimíd eitidiam. Is gnách a glóthacha agus a tuaslagáin a scaradh amach mar dhramhaíl cheimiceach ghuaiseach, mar a luaitear i dtreoir Thermo Fisher do dhatháin aigéad núicléasach. Lean an SDS agus rialacha na hinstitiúide don dá cheann. Coinnigh dathán tirim dúnta go docht agus tirim, ná hathúsáid dathán oibre ach amháin mar a cheadaíonn an prótacal, stóráil scannáin dhathaithe tirim idir leatháin scagpháipéir, agus tóg grianghraif de ghlóthacha sula scaipeann na bandaí amach trí idirleathadh.

Cuimhnigh ar an abairt don bhinse saotharlainne. Déanann glóthacha infheictheacht a thástáil ag luchtú ard faoi sholas bán. Déanann scannáin aistriú agus luchtú a thástáil sula ndéanann an phróib an obair íogair. Freastalaíonn dathán amháin ar an dá thasc, le híogaireacht mheasartha, ceangal inchúlaithe agus ord docht oibríochtaí.