Metylenblátt í sebrafiskagransking: ískoyti til røkt og órógvandi táttur í royndum

Vatn til sebrafiskaegg er ofta veikt blátt, og næstan eingin skrivar niður hví. Litevnið er metylenblátt, sum verður lagt afturat móti soppi, og flestu mannagongdir viðgera tað sum bakgrund. Bakgrund er skeiva hugtakið her. Eitt betri hugtak er ein óskrásettur royndartáttur: nakað, sum er til staðar í viðgjørdum skálum og ikki í eftirlitsskálum, er farmakologiskt virkið við teimum styrkjum, sum verða brúktar, og kann broyta júst tey endapunktini, sum royndin mátar.

Hesin munurin skipar alt niðanfyri. Vanlig røkt móti soppi er ein spurningur. Um ískoytið er neutralt í tíni kanning, er ein annar. Nýggjar vísindagreinar um sebrafisk svara fyrra spurninginum á ein tryggjandi hátt og seinna á ein órógvandi hátt.

Hvat leiðreglurnar í veruleikanum fyriskriva

Tað er eingin felags standardur, og tað er ein partur av trupulleikanum. Leiðreglurnar hjá Canadian Council on Animal Care loyva 0.5 mg/L, ella 0.00005%, í flutningsloysn til egg og larvur fyri at minka um soppavøkstur. Evropeiskar leiðreglur um royndardjór lýsa fostur, sum verða hildin í miðli, ið ofta inniheldur somu 0.00005%. E3-uppskriftin hjá Cold Spring Harbor ásetur tvífalt so nógv, 1 mg/L ella 0.0001%, sum eitt tilfar í uppskriftini. Móti hesum stendur eitt eyðsýnt frával: OECD-leiðreglan fyri eiturvirknisroyndir á fiskafostrum ásetur endurskapað tynningarvatn og royndarevni, men hevur onga tilráðing um metylenblátt, hvørki í útgávuni frá 2013 ella í seinni endurskoðanini. Sostatt elur ein starvsstova sebrafiskafostur við metylenbláum í bláum vatni frá fyrstu lívstímunum, meðan ein onnur ger myndugleikakravdu fosturkanningina í klárum vatni, og báðar kalla sín miðil vanligan. Tey, sum samanbera úrslit millum starvsstovur ella savna eldri eftirlitsdátur, fáa hesa ósamsvaran við í keypinum.

Til samanberingar av styrkjum er 0.00005% umleið 1.56 micromolar og 0.0001% umleið 3.13 micromolar. Hetta eru lág tøl, og tað er freistandi at tulka tey sum ov lág til at hava týdning. Kanningarnar niðanfyri royna júst hesa hugsanina, við júst hesum styrkjum.

Lesarar, sum koma frá fiskahaldi heldur enn starvsstovuni, hitta somu sameind í øðrum høpi, sum verður lýstur í akvariumleiðbeiningini um metylenblátt. Evnafrøðin er tann sama; frágreiðingin um, hvussu litevnið flytur elektronir gjøgnum kyknur, greiðir frá, hví eitt redoksvirkið evni aftur og aftur kemur fyri í greinum um evnaskifti. Tað, sum kemur niðanfyri, snýr seg serstakt um vatn til sebrafiskaegg við metylenbláum.

Evnaskifti: árinið skiftir fortekn við menningarstigi

Kanningin, sum gevur mest innlit, útsetti sebrafisk við vanligari menning fyri evninum frá fyrsta lívsdegi til 5 dagar eftir gitnað og mátaði oksidativt evnaskifti á hvørjum stigi, sum lýst í útgivnu frágreiðingini um royndirnar við fosturevnaskifti. Mynstrið eigur at verða lýst nágreiniliga, tí tað vendir kós.

1 dag eftir gitnað øktist grundleggjandi súrevnisnýtslan hjá útsettum fostrum við báðum røktarstyrkjunum. Við 2 dagar var membranpotentialið í mitokondriunum í yvirflatulagnum á larvunum hækkað við útseting fyri 0.00005%, 0.0001% og 0.0003%. Við 4 til 5 dagar, eftir kleking, var forteknið vent: oksidativa orkunýtslan minkaði, bæði tá útsetingin hevði verið samanhangandi frá gitnaði, og tá hon bert hevði verið bráð frá degi 3 til dag 4. Samstundis minkaði nøgdin av transkriptum fyri undireindir í andingarkompleksum í mitokondriunum bæði við 1 og 4 dagar, saman við transkriptum knýttum at steroidmyndun og glukoneogenesu.

Tvær aðrar eygleiðingar gera myndina greiðari. Klekingin fór fram eitt sindur fyrr við hægru røktarstyrkini, har útsettu fostrini vóru frammanfyri við 2 dagar, og eftirlitsfostrini høvdu tikið tey aftur við dag 3. Og sjálvur stressásurin tóktist vera óskaddur: tá 5 daga gamlar larvur vórðu útsettar fyri stressi við hvirlandi rørslu, hækkaði kortisol í øllum kroppinum sum vanligt í báðum bólkum. Litevnið er sostatt ikki eitt alment menningareitur við hesum nøgdum, og tað køvir ikki øll fysiologisk aftursvar. Tað broytir orkuevnaskiftið eftir menningarstigi, uppeftir áðrenn kleking og niðureftir aftaná.

Atferð: hví tvær kanningar eru ósamdar, og hví báðar kunnu hava rætt

Vísindagreinarnar um atferð tykjast mótsigandi, inntil útsetingarsniðini verða løgd lið um lið. Ein trygdarkanning av menning og atferð útsetti fostur frá umleið 6 tímum eftir gitnað fyri styrkjum upp til 10 micromolar, endurnýggjaði loysnirnar dagliga til og við dag 4, flutti síðani larvurnar í litevnisfrían miðil á døgunum 5 og 6 og kannaði flytiatferð í eini ljós-myrkurroynd á degi 6. Úrslitið: eingin signifikant ávirkan á deyðiligheit, kleking ella kropsskap, og eingin viðgerðarávirkan á flytiatferð. Høvundarnir tilráddu rímiliga 10 micromolar sum eitt ovara mark undir teirra umstøðum.

Ein annar bólkur, við summum av somu høvundum sum evnaskiftiskanningin, skipaði útsetingina soleiðis, sum røktin í veruleikanum fer fram: litevnið var til staðar frá 2 til 3 tímum eftir gitnað við dagligari lutvísari endurnýggjan, og atferðin varð mátað, meðan útsetingin framvegis fór fram ella stutt eftir hana. Við somu vanligu styrkjum vístu larvur minni flytiatferð í eini 24 tíma kanning, sum kundi endurtakast tvørtur um linjur og starvsstovur, og kanningin av órógv í atferðarroyndum knýtti árinið at serotonergum virkni, í samsvari við kendu tálmingina av monoaminoksidasu hjá litevninum. Mest sigandi var, at fosturmiðil við metylenbláum fjaldI væntaða aftursvarið í flytiatferð til SSRI-evnið fluoxetin. Ein skimingarroynd í bláum vatni kann tí missa eitt heilivágsárin, sum klárt vatn hevði avdúkað.

Tað er eingin verulig mótsøgn. Eitt evni kann vera uttan ávísiligt eftirárin tveir dagar eftir útskoling í eini kanning og kortini vera virkið, meðan tað er til staðar í eini aðrari. Tann verkliga tulkingin er, at nullúrslitið gevur grundarlag fyri einum ovara styrkimarki, ikki fyri einum páhaldi um neutralitet, meðan positiva úrslitið lýsir tann váðan, sum hevur týdning: virkin útseting í mátitíðarskeiðinum, í júst teirri uppseting, sum flestu starvsstovur brúka.

Eitt redokslitevni inni í eini redoksroynd

Ein onnur fella hevur uppiborið sína egnu grein, tí hon órógvar mátingarháttin heldur enn djórið. Alamar Blue-royndin av orkunýtslu byggir sjálv á redoksevnafrøði: resazurin verður redusert til fluorescerandi resorufin. Metylenblátt virkar eisini við redoksevnafrøði. Í kyknufríum eftirlitsroyndum minkaðu báðar røktarstyrkirnar Alamar Blue-fluorescensin lítið, men signifikant, eftir 24 tímar. Í djóraroyndunum vórðu útsett fostur skolað minst tríggjar ferðir í litevnisfríum miðli áðrenn kanningina, og lívfrøðiliga árinið hjá klaktum larvum var størri enn kyknufría órógvið. Bæði eru tí sonn: skolað djór hava eitt veruligt evnaskiftisárin, og litevni, sum ikki er skolað burtur, leggur eina beinleiðis evnafrøðiliga mátingarvillukeldu omaná. Eftirlitsroyndir mugu skilja hesi bæði sundur, annars hevur hvørki tal nakað virði. Almenn leiðbeining um at tulka úrslit úr litevnisgrundaðum royndum er serliga viðkomandi her.

Tíðarlinja fyri menningarstig

Upprunaliga tilfarið til hesa greinina. Styrkirnar eru tey bæði vanligu røktarvirðini, 0.00005% og 0.0001%, um annað ikki er tilskilað.

Mynstrið at minnast er ein tíðlig hækking og ein seinni lækking í evnaskiftisendapunktum, við atferðarávirkan undir útseting, sum ikki kundi ávísast eftir útskiljing í teirri einu royndini, ið kannaði tað.

Eftirlitslisti til sniðgeving av eftirlitsroyndum

Hitt upprunaliga tilfarið. Brúka tað, tá mannagongdir fyri sebrafisk við metylenbláum verða partur av eini roynd.

1. Skráset litevnið sum eitt reagens, ikki sum vatn. Tilskila styrkina bæði í prosentum og micromolar, byrjan og enda í tímum ella døgum eftir gitnað, ætlanina fyri endurnýggjan og útskolingartíðina undan hvørjari máting.
2. Laga eftirlitsroyndirnar eftir spurninginum. Ein kanning av royndarevninum krevur litevnisfríar eftirlitsroyndir; ein kanning av røkt krevur litevnisfríar bólkar samanbornar við bólkar við litevni, har úrslitið móti soppi verður skrásett, tí hvørgin av nevndu kanningunum mátaði virknið móti soppi.
3. Skola undan redoksroyndum, og eftirkanna síðani. Skola minst tríggjar ferðir í litevnisfríum miðli og ger samstundis eina kyknufría eftirlitsroynd við litevni og reagensi, tí litevnið beinleiðis minkar Alamar Blue-signalið.
4. Met atferðar- og monoaminendapunkt sum serliga viðkvom fyri órógvi. Kanningar av flytiatferð, hvøkking, angistarlíknandi atferð, antidepressivum evnum og MAO-tálmarum eiga at sleppa undan litevninum undir máting ella vísa, at tað er neutralt fyri viðkomandi endapunkt; útskoling í ein til tveir dagar tók burtur eitt árin á flytiatferð, men er ikki prógvað fyri aðrar royndaruppsetingar.
5. Met evnaskiftis- og mitokondriuendapunkt sum serliga viðkvom fyri órógvi á øllum stigum. Súrevnisnýtsla, orkunýtsla, membranpotentiali og transkript fyri andingarketuna broytast við røktarstyrkjum, í øvugum ættum áðrenn og eftir kleking.
6. Flyt ikki neutralitet millum royndarsnið. Eitt nullúrslit eftir útskoling fevnir ikki um áhaldandi útseting; eitt nullúrslit fyri kropsskap fevnir ikki um evnaskifti ella samvirkan við heilivág; eitt úrslit fyri eina linju, eitt hitastig ella eina kanningarlongd fevnir ikki um onnur.
7. Tilskila leiðregluna, tú fylgdi, og alternativið til hana. Nevnið styrkirnar hjá CCAC, í evropeisku leiðreglunum ella hjá Cold Spring Harbor beinleiðis, og viðmerk, hvar OECD-fosturroyndin ikki tekur litevnið við, so lesarin kann seta tíni djór í rætt høpi.

Einki av hesum talar ímóti at brúka litevnið til at halda eggjum á lívi. Tað talar ímóti at lata eitt røktarval koma ókannað inn í dáturnar. Tað bláa í skálini er ein sameind við farmakologiskum eginleikum, og royndirnar, sum helst verða skeiklaðar, eru júst tær evnaskiftis- og neuroatferðarskimingar við stórari gjøgnumstreyming, sum ungir sebrafiskar nú verða valdir til. Skráset tað, hav eftirlit við tí, skola tað burtur áðrenn máting, og eftirkanna royndina, sum tað kanska tekur lut í uttan at gera vart við seg.