Gerroyndir við metýlenbláum: teljing av livandi kyknum samanborið við tíðarmáting av anding

Tvey royndarglø eru á starvsstovuborðinum. Bæði eru blá. Í øðrum merkja bláar kyknur undir sjóneykuni, at gerið er deytt. Í hinum merkir eitt royndarglas, sum fer frá bláum til litloyst, at gerið er livandi og andar. Sama litievni, mótsettar tulkingar. Verða tær báðar royndirnar blandaðar saman, verða allar niðurstøður øvutar.

Hesin munurin er evnið í allari greinini. Metýlenblátt er eitt redox-litievni: í oxideraðum líki er tað blátt, í reduséraðum líki er tað litloyst leukometýlenblátt. Ein lívføristeljing nýtir hesa evnafrøðina til eina stutta løtumynd undir sjóneyku. Ein andingarroynd nýtir hana í einum tíðarmátaðum viðbragdi í allari blandingini. Hvør teirra krevur sína egnu mannagongd, sínar egnu eftirlitsroyndir og sín egna kritiska hugburð.

Lívføristeljingin: stutt liting, sum verður lisin beinanvegin

Mannagongdin, sum verður brúkt í bryggjaríum, er tann mest standardiseraða útgávan. Ger 0.01% w/v metýlenblátt í 2% natriumsitrat, blanda tað 1:1 við geruppslemmingina, og kanna blandingina eftir eitt stutt, fast tíðarskeið. Útgivnar mannagongdir áseta frá 1 til 2 minuttir í handbókini hjá Brewing Science Institute til umleið 5 minuttir í granskingarmannagongdum, meðan OIV-hátturin til mikrobiologiska kanning av víni krevur kanning innan 10 minuttir. Litievnið í teljiblandingini endar nær 0.005%. Fyll eitt bøtt Neubauer-teljikamari, og flokka við umleið 400x myrkabláar kyknur sum ikki lívførar og ólitaðar kyknur sum lívførar. Ljósabláar kyknur verða mettar sum livandi í OIV-háttinum, og hetta bendir longu á trupulleikan við subjektivari meting, sum verður viðgjørdur niðanfyri.

Kyknutættleikin verður roknaður út frá mátingunum í teljikamarinum. Tá ið alt miðøkið, ein fýrakantur við 1 mm síðulongd, verður talt, er talið av kyknum fyri hvønn mL N ferðir tynningarfaktorurin ferðir 10^4, har N er talið av kyknum í hesum øki, sum lýst í ASBC-háttunum til gerkanningar. Lívføri er einfaldari: ólitaðar kyknur býttar við samlaða talinum av kyknum, ferðir 100. Tel umleið 400 kyknur fyri at meta um lívføri, í samsvari við FEMS-samanberingarroyndina í bryggjaríum og OIV-mannagongdina. Brúka somu markreglu alla tíðina, til dømis at telja kyknur á niðaru og vinstru netlinjunum við og ikki telja tær á ovaru og høgru linjunum við.

Ein regla fyri knoppar má ásetast, áðrenn teljingin byrjar. Ein vanlig regla er at telja ein knopp sum eina sjálvstøðuga kyknu, tá ið hann er umleið helvtina so stórur sum móðurkyknan, og annars saman við móðurkyknuni. Óansæð hvør regla verður vald, skal hon brúkast í hvørjum fýrakanti og skrivast á teljiarkið, so næsti persónurin kann gera tað sama.

Teljiark (prenta hetta)

Hetta teljiarkið er upprunaligt tilfar til hesa greinina. Avrita tað í eina notubók ella prenta eitt fyri hvørja roynd.

Lívføri (%) = 100 x ólitaðar / (ólitaðar + myrkabláar). Samlað tal av kyknum fyri hvønn mL = N x tynningarfaktorur x 10^4, har N kemur frá tí ásetta økinum í teljikamarinum. Skráset lititíðina við úrslitið, tí eitt lívføristal uttan tíðaráseting kann ikki endurskapast.

Hví lívføristøl broytast

Tíðin er fyrsta órógvandi viðurskiftið, og hon kann ávirka báðar vegir. Kyknur við virknari evnaskiftistilgongd reduséra litievnið, so ein tíðlig avlesing kann fanga livandi kyknur, áðrenn tær eru lidnar við at reduséra tað, og skeivt flokka tær sum deyðar. Men langvarandi ávirkan frá litievninum er í sjálvum sær eitrandi og skapar veruliga skaddar, bláar kyknur, sum geva falska liting fyri deyða. Ein starvsstovumannagongd til undirvísing ásetur tí, at metingin skal gerast innan 5 minuttir, sum skjalprógvað í eini Wisconsin-mannagongd til undirvísing við geri. Trygga orðingin er, at meting við metýlenbláum er tíðartreytað; vel tí eitt stutt tíðarskeið og halt tað óbroytt fyri allar royndir í eini røð.

Royndir við lágum lívføri hava eina aðra skeivleika. Standardiseraði hátturin ávarar um, at metýlenblátt kann yvirmeta veruligt lívføri undir umleið 80%, tí kyknur, sum enn reduséra litievnið, ikki endiliga hava varðveitt førleikan at nørast. Bryggjaríbókmentir lýsa sama óálítandi úrslit, tá ið lívførið er munandi versnað. Met um metýlenblátt sum eina skjóta, áleið meting, og vátta avgerðir, har lágt lívføri hevur stóran týdning, til dømis um at endurnýta eina germentan til nýggja brygging, við koloniteljing á plátum ella einari ískoytisliting.

Ávirkan frá sjálvum royndartilfarinum kemur sum tað triðja. OIV-hátturin verður framdur nær pH 4.6 og ávarar um, at royndir við lágum pH og sterkari buffurvirkni forða litievninum í at virka rætt. Hann mælir eisini frá at brúka kanningina, tá ið sukurnøgdin er omanfyri 100 g/L, tí kyknurnar tá síggja villleiðandi ljósabláar út. Ein royndarsamanbering av pH undir liting vísti munandi broytta viðkvæmi í tí kannaða økinum, í samsvari við eina kanning av pH-treytaðum metýlenbláum kanningarhátti. Leivdir eru ein serstøk fella: litaðar bitlar í óreinum meski líkjast deyðum kyknum og økja um munin millum metingar hjá ymiskum starvsfólkum.

Hesin munurin er tølfestur, ikki bara grundaður á einstakar upplivingar. Í einari seks mánaða bryggjaríroynd, sum er lýst í FEMS-samanberingini av gerkanningum, høvdu dupultmátingar við metýlenbláum í miðal 6.1% staðalfrávik samanborið við 0.2% fyri oxonol-streymcytometri, og tvey starvsfólk høvdu upp til 13 prosentstig á muni í somu roynd. Ein kvantitativ samanbering av lívførisháttum frá 2023 vísti, at fluorescenssjóneykukanning og streymcytometri vóru munandi neyvari, men eisini at úrslitagóðskan er treytað av slagi og royndartilfari. Klassiska háttalýsingin hjá Painting og Kirsop (PMID 24430080) er framvegis grundarlagið, og eitt breiðari yvirlit yvir kanningar av lívføri og lívsvirkni í geri (PMID 25154541) setur metýlenblátt millum ískoytiskanningar heldur enn endaligar kanningar. Trypanblátt er ikki sjálvvirkandi ein betri loysn her: tað vísir, at kyknuhinnan hevur mist sítt heila skap, meðan metýlenblátt vísir upptøku saman við reduktiónsvirkni. Tí kunnu kyknur undir strongd verða flokkaðar ymiskt við teimum báðum litievnunum.

Andingarroyndin: máta tíðina, til tað bláa hvørvur

Hin kanningin verður als ikki gjørd við sjóneyku. Ger, glukosa og tunt metýlenblátt verða latin í eitt afturlatið royndarglas, og klokkan mátar, hvussu leingi tað tekur tí bláa litinum at hvørva. Tá ið kyknurnar hava evnaskifti, skapa tær reduktiónsekvivalentar, sum broyta bláa litievnið til tess litleysa líki, meðan upployst súrevni oxiderar tað aftur. Tá ið kyknurnar hava minkað um súrevnið, vinnur samlaða reduktiónin, og royndarglasið missir litin. Endapunktið endurspeglar tí javnvágina millum anding, litievnistættleika og atgongd til súrevni. Úrslitið eigur at verða skrásett sum reduktións- ella avlitingartíð fyri metýlenblátt, ikki sum ein beinleiðis máting av nýtsluferðini av molekylerum súrevni.

Brúka nógv tynri litievni enn í lívføriskanningum, so tíðarmátingin liggur í einum hóskandi øki. AQA-handbókin til kravdar verkligar A level-royndir standardiserar hetta væl: 1 g glukosa fyri hvørjar 100 mL av vatni, sum er hitað til umleið 30 C, 5 g av turrgeri latið í beint áðrenn nýtslu, og ein brúkslitloysn nær 0.001%, gjørd við at tynna 0.1 mL av eini 1% stamlitloysn upp í 100 mL. Blanda 2 mL av ger-glukosuuppslemming við 2 mL av brúkslitloysnini, lat blandingina fáa sama hita sum royndarhitin, rist eina ferð í 10 sekund, set tíðarmátaran í gongd, og rist ikki aftur. Risting letur súrevni koma aftur í blandingina og ger royndarglasið blátt aftur; hetta er størsta einstaka villukeldan í mannagongdini. AQA viðmerkir, at blandingin vanliga eigur at missa litin innan umleið 5 minuttir við 35 C, við royndarmiðaltølum á 275 s við 20 C, 128 s við 35 C og 145 s við 45 C. Hetta eru dømi frá einari royndaruppseting, ikki almenn viðmiðunartøl. Tølfrøðiliga sambandið millum reduktiónsferð og ger við virknum evnaskifti undir stýrdum umstøðum verður stuðlað av serligum reduktiónskanningum, millum annað arbeiði skrásett sum PMID 25773544 og kanningini av mekanismuni í Yeast (2014).

Dømi um tíðargongd (upprunaligt tilfar)

Talvan niðanfyri er eitt upprunaligt dømi gjørt til hesa greinina við AQA-líknandi uppsetingini, sum er lýst omanfyri: 2 mL av ger-glukosublanding saman við 2 mL av brúkslitloysn nær 0.001%, ein risting í 10 sekund og síðan inkubatión uttan órógv. Skrásetingarnar eru dømi um avlesingar í tí sniði, sum ein næmingabólkur eigur at brúka, har ferðvísitalið er allýst sum 1 býtt við avlitingartíðini í sekundum. Ger somu royndir og skift hesar skrásetingarnar út við máld virði.

Tekna ferðvísitalið sum funktión av hitanum fyri royndarglø A, B og C. Kurvan hækkar og flatar síðan út ella lækkar; hetta er væntaða mynstrið fyri eina ensýmstýrda tilgongd, ikki ein bein linja. Royndarglø D, E og F eru ikki dátupunkt á hesi kurvu. Tey eru eftirlitsroyndirnar, sum gera tað møguligt at tulka kurvuna.

Eftirlitsroyndir, sum geva hvørjari kanning innihald

Hvør andingarroynd krevur tríggjar fylgiroyndir. Kókað ella dripið ger saman við glukosu og litievni eigur at verða verandi blátt, og tað vísir, at skjót reduktión er treytað av livandi evnaskifti. Livandi ger saman við litievni uttan ílatna glukosu er ein substrat-eftirlitsroynd, men vænta kortini spakuliga avliting, tí gerið brúkar sínar innanhýsis goymslur. Glukosa saman við litievni uttan ger er evnafrøðiliga blankroyndin, sum er avgerandi, tí glukosa í basiskum umhvørvi kann reduséra metýlenblátt, hóast ongar kyknur eru til staðar.

Lívføristeljing krevur eitt annað slag av eftirliti: óbroytta mannagongd. Sama stamlitloysn, sama blandilutfall, sama lititíð, sama øki í teljikamarinum og somu knoppareglur og markreglur, við blindari teljing har tað ber til. Tá ið tvey starvsfólk víkja tíggju prosentstig frá hvørjum øðrum, vísir teljiarkið vanliga orsøkina: ymisk tíð, ymiskur markvirði fyri bláan lit ella ymiskar knoppareglur. Hættirnir til at gera litaðar kyknur klárar og hyggja at teimum hava samband við einfaldar hættir til bakterialiting, meðan eitt breiðari yvirlit yvir, hvat litievnið merkir í ymiskum royndum, er í atlasi fyri sjóneykuliting. Viðvíkjandi alisfrøðini aftan fyri kvantitativa avlesing av styrkini í bláum liti greiðir absorptiónstilvísingin við ásettum umstøðum frá, hví hvør stuðul má fylgjast av upplýsingum um loysingarevni, pH og tættleika.

Vel kanningina eftir spurninginum. Hvussu nógvar kyknur eru livandi beint nú er ein teljispurningur, sum verður svaraður við sjóneyku og teljiarki. Hvussu virkið henda germentanin andar er ein kinetiskur spurningur, sum verður svaraður við stoppuri og royndargløsum undir stýrdum umstøðum. Metýlenblátt kann brúkast til bæði, men ongantíð í sama royndarglasi samstundis.