Metylenblátt í G6PD-starvsstovuroyndum: hvat litevnið í veruleikanum ger

Ein lesandi eygleiðir tvey royndargløð eftir inkubatión. Annað hevur fingið væntaða litin. Hitt hevur ikki. Tann lesandi kemur til ta niðurstøðu, at seinni sjúklingurin hevur trot á glukosu-6-fosfat-dehydrogenasu. Niðurstøðan kann vera røtt, men grundgevingin leypur um ta meginreglu, sum fær royndina at virka. Einki í royndarglasinum mátar ensímið beinleiðis. Royndarglasið mátar tað, sum ensímið framleiðir, við metylenbláum sum millumliði.

Tá ið henda óbeinleiðis mátingin er greið, tykjast mannagongdin, kontrolroyndirnar og langi listin av skeivum úrslitum ikki longur tilvildarlig.

Stutta svarið

Metylenblátt í G6PD-royndum er ein redoxávísari. Ensímið G6PD framleiðir NADPH, og NADPH-treytaðar skipanir reducera blátt metylenblátt til tess litleysa leukoform, ella nýta tað til at flyta elektronir. Vanligt ensímvirksemi gevur munagóða reduktión. Ov lítið virksemi gevur seinføra ella ófullfíggjaða reduktión. Hetta er alt teknið, sum royndin gevur.

Tvær søguligar mannagongdir nýta sama litevni, men hava ymisk endapunkt. Halt tær sundur, so hvørvur meginparturin av ørkymlanini.

Tvær royndir, eitt litevni, ymisk endapunkt

Tann fyrra er beinleiðis reduktiónsroyndin við metylenbláum, sum Sass og starvsfelagar lýstu, og sum Gibbs seinni metti um. Her er litevnið sjálvt endapunktið: oxiderað, blátt metylenblátt verður reducerað móti litleysum leukometylenbláum, og ferðin á hesi broyting endurspeglar førleikan at framleiða NADPH. Upprunaliga greinin um skiming er skrásett á PubMed undir Sass o.fl. (1966).

Tann seinna er Brewer-reduktiónsroyndin við methemoglobini. Natriumnitritt oxiderar fyrst hemoglobin til brúnt methemoglobin. Metylenblátt virkar síðan sum millumliður í elektronflutningi: reducerað metylenblátt flytur reduktiónsekvivalentir til methemoglobin og broytir tað aftur til reytt hemoglobin. Sjónliga endapunktið er tí brúnt mótvegis reyðum, ikki blátt mótvegis litleysum. Upprunaliga mannagongdin varð kunngjørd í Bulletin of the World Health Organization (Brewer o.fl., 1960).

At kalla Brewer-royndina eina avlitingarroynd er kemiskt óneyvt. Litevnið skiftir millum oxiderað og reducerað form; hemoglobinið broytir lit. Myndin niðanfyri vísir báðar reaktiónsleiðirnar.

Undirliggjandi reaktiónin

G6PD katalyserar fyrsta oxidativa stigið í pentosufosfatleiðini:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Búnir reyðir blóðkroppar eru í stóran mun bundnir at hesi leið fyri at fáa NADPH, sum lýst í Blood av Luzzatto og starvsfeløgum (2020). NADPH heldur glutathion í reduceraðum formi og verjir kyknuna móti oxidativum skaða. Metylenblátt verður partur av hesum samspæli sum elektronmóttakari. Nóg mikið av G6PD gevur nóg mikið av NADPH, sum gevur munagóða reduktión. Ov lítið av G6PD brýtur ketuna við fyrsta liðið.

Hugsa um litevnið sum ein brennievnismátara, ikki motorin. Tað vísir, hvussu nógv NADPH er tøkt. Alt annað, sum broytir tøku nøgdina ella avlesingina, kann flyta nálina, uttan at nakar broyting er í geninum.

Hvussu mannagongdin av Brewer-slagi fer fram

Samansetingin av reagensum hevur verið ymisk gjøgnum áratíggjuni, so ein lýsing til undirvísing má ikki skiljast sum ein kliniskur royndarprotokollur. Hvør starvsstova fylgir sínari egnu gildu standardmannagongd. Við hesum fyrivarni fer klassiska royndin í royndargløsum fram soleiðis, í einum formi, sum er lýst við trimum royndargløsum og 3 tíma inkubatión í hesi útgivnu lýsingini av mannagongdini:

1. Royndarglas við sjúklingasýni: heilblóð saman við glukosu, natriumnitritti og metylenbláum. Nitritt myndar methemoglobin, glukosa veitir evni til evnaskiftið í reyðu blóðkroppunum, og litevnið virkar sum NADPH-treytaður elektronflytari.
2. Oxiderað kontrolsýni: blóð saman við nitritti og glukosu, men uttan metylenblátt. Tað vísir brúna methemoglobin-endapunktið, mynstrið við troti.
3. Hemoglobin-kontrolsýni: blóð saman við vatni. Tað vísir reyða hemoglobin-endapunktið, vanliga mynstrið.
4. Inkubera øll royndargløð við umleið 37 C, vanliga í 3 tímar, og blanda varliga.
5. Tynn ein lítlan part av innihaldinum í hvørjum royndarglasi við destilleraðum vatni fyri at loysa kyknurnar upp og gera tað lættari at samanbera litirnar.
6. Samanber royndarglasið við sjúklingasýninum við bæði kontrolsýnini. Ein broyting aftur móti reyðum vísir týðandi reduktiónsførleika. Verður liturin verandi móti brúnum, bendir tað á týðiligt trot.

Ein søgulig samanseting nýtti umleið 1 mL av blóði við reagensum nær 180 mM natriumnitritti, 280 mM dextrosu og 0.4 mM metylenbláum. Skil hesi tøl sum eitt dømi úr bókmentunum, ikki sum ein alment galdandi standard.

At lesa úrslitið

Ein kvalitativ skiming skilur best ímillum við umleið 30 til 40 prosent av vanligum virksemi, sum umrøtt í hesi yvirlitsgrein í Malaria Journal um manglar í ávísing av G6PD-troti. Eitt vanligt skimingarúrslit merkir tí, at royndin ikki ávísti álvarsligt trot. Tað staðfestir ikki, at virksemið er heilt vanligt.

Hví skiming kann villa

Retikulocytosa eftir hemolysu er klassiska orsøkin til eitt falskt vanligt úrslit. Ungir reyðir blóðkroppar og retikulocytar innihalda meira G6PD enn gamlir blóðkroppar. Undir eini bráðari hemolysu kunnu teir elstu blóðkropparnir við størsta trotinum longu vera oyðilagdir. Eftir er tá ein ungur kyknubólkur, hvørs virksemi verður mátað sum vanligt. Sama lívfrøðiliga fyribrigdið villir eisini kvantitativar royndir, ikki bert skiming við litevni.

Nýlig blóðflutningur kann fjala trot, tí reyðir blóðkroppar frá gevaranum leggja sítt egna ensím afturat sýninum. Mayo Clinic Laboratories nevnir blóðflutning millum orsøkirnar til óálítandi ensímúrslit, saman við retikulocytosu og órógvi frá hvítum blóðkroppum.

Heterozygotar kvinnur eru torførasti bólkurin at meta um. Tilvildarlig óvirkjan av X-kromosominum skapar eina blanding av vanligum reyðum blóðkroppum og reyðum blóðkroppum við troti. Samlaða virksemið kann tí liggja hvar sum helst frá álvarsligum troti til eftir øllum at døma vanligt virksemi. Kvalitativar skimingar finna ofta ikki fenotypur á millumstigi. WHO-skjølini um G6PD-royndir umrøða hesa avmarking í smálutum.

Aldurin á sýninum, goymsluhitin, subjektiv meting av sjónliga endapunktinum, hematokritt og góðskan á reagensunum geva harumframt analýtiskt órógv afturat hesum lívfrøðiligu ávirkanunum.

Skiming er ikki diagnosa

Eitt skimingarúrslit, sum vísir trot ella millumstig, ella sum ikki samsvarar við klinisku myndina, krevur eina kvantitativa G6PD-ensímroynd. WHO metir kvantitativa spektrofotometri við stýrdum hita sum tilvísingarmannagongdina. Í teirri royndini verða glukosu-6-fosfat og NADP+ sett afturat einum hemolysati av reyðum blóðkroppum, og NADPH, sum verður myndað, verður fylgt við at máta vaksandi absorbans við 340 nm. Broytingarferðin er lutfalslig við ensímvirksemið, sum vanliga verður umroknað í mun til hemoglobinnøgdina og givið upp í eindum fyri hvørt gramm. Núverandi mannagongd á kliniskum starvsstovum er samandráttarliga lýst í royndarskránni hjá Mayo fyri G6PD-virksemi.

Tulkingin nýtir gildu tilvísingarmørkini hjá starvsstovuni, ofta sett í mun til vanligt virksemi í fólkabólkinum. Trot verður vanliga umrøtt við markinum á umleið 30 prosent, og virksemi á millumstigi liggur omanfyri tað. WHO-málvørulýsingarnar fyri G6PD-royndir (2022) lýsa henda diagnostiska karmin. Um nýlig hemolysa ella blóðflutningur ger fenotypuásetingina óálítandi, skal royndin endurtakast, tá ið samansetingin av reyðum blóðkroppum aftur er í javnvág. Molekylerar royndir kunnu geva fleiri upplýsingar, men koma ikki í staðin fyri ensímmátingina.

Eitt mark, sum eigur at varðveitast

Metylenblátt í hesum royndum er eitt ex vivo-starvsstovureagens. Hetta er eitt annað evni enn trygdin við at geva einum sjúklingi metylenblátt, sum verður umrødd í vegleiðingini um kontraindikatiónir fyri metylenblátt. Lívkemin bindur hesi evni saman, tí heilivágurin eisini er bundin at NADPH-treytaðari reduktión. Men litevni í einum royndarglasi er ikki ein skamtur í blóðrenslinum. Fyri at síggja, hvussu litevnið virkar til liting í einum øðrum samanhangi, sí meginreglur fyri liting við metylenbláum. Fyri kemiska bólkin, sum tað hoyrir til, sí redoxlitevni á starvsstovuni.

Skiming kannar, um reduktiónsførleikin tykist vera varðveittur. Staðfesting kannar, hvussu nógv ensím í veruleikanum er til staðar. Litevnið svarar fyrra spurninginum væl, treytað av at eingin biður tað svara tí seinna.