Metylenblátt til DNA- og RNA-liting: nýtsla í gelum og á membranum

Ein lesandi koyrir eitt agarosugel, litar tað við metylenbláum og sær einki har, sum eitt týðiligt band skuldi verið. Við næsta arbeiðspláss litar ein postdoktor eina Northern-membran við sama bláa litievni og fær skørp ribosomal bond eftir tríggjar minuttir. Tann lesandi heldur, at gelkoyringin miseydnaðist. Gelkoyringin miseydnaðist ikki. Uppgávurnar vóru ymiskar, og sama litievni loysir tær við ymiskum næmi, ymiskari bakgrund og ymiskum reglum fyri eftirfylgjandi arbeiði.

DNA- og RNA-liting við metylenbláum byggja á somu kemi, men hava ymisk endamál. Í einum geli vísir litievnið, hvussu nógv nukleinsýra er inni í einum porøsari matriks. Á einari membran vísir tað, um flytingin eydnaðist, og um javnt nógv varð lastað í gelrásirnar. Tá ið hesin munur er greiður, verða mannagongdirnar, ávísingarmørkini og avmarkingarnar í sambæriligheit lættari at skilja.

Stutta svarið

Metylenblátt er eitt flatt, kationiskt litievni, sum bindur nukleinsýrur ikki-kovalent og vendiliga við einari blanding av elektrostatiskum atdráttarkraftum mótvegis fosfati, innskoti millum basupør og binding í smalu foyruni. Tað vendiliga er sjálvt endamálið. Bond kunnu litast og síggjast í sjónligum ljósi, skrásetast og síðan avlitast ella reinsast til kloning, hybridisering ella nýggja kanning við einari proba.

Til liting av tvístrongdum DNA í agarosugelum við metylenbláum er vanliga skjóta uppskriftin 0.02 prosent w/v (200 mikrogramm fyri hvønn mL) í vatni, umleið 15 minuttir av liting og síðan umleið 15 minuttir av avliting í vatni, við avlestri á einum ljósborði við hvítum ljósi. Til membranir er klassiska Northern-blotuppskriftin 0.02 til 0.04 prosent litievni í natriumacetati nær pH 5.2, nakrir minuttir av liting eftir flyting og festing, síðan skoling við vatni og full avliting undan hybridisering. Næmið er avmarkað: tíggjutals til hundraðtals nanogramm fyri hvørt gelband undir góðum umstøðum, og varligar vegleiðingar tilskila 0.5 til 1 mikrogramm. Hetta er fleiri støddarstig oman fyri ávísingarmørkini hjá etidiumbromidi og SYBR-litievnum. Á membranum er einki einstakt, nýtiligt ávísingarmark fyri eitt ávíst transkript, tí litingin vísir fyrst og fremst ribosomalt RNA, sum er til staðar í stórum nøgdum, og alt tað lastaða tilfarið. Brúka ikki eina loysn, sum verður seld sum kostískoyti í smásølu, í nakrari av hesum uppskriftum. Staðfestar mannagongdir byggja á litievni av analytiskari góðsku, nágreiniliga samansettar buffarar og RNase-fría handfaring, tá ið arbeitt verður við RNA.

Hvussu bindingin virkar, og hvar hon kann villleiða

Nýtiliga myndilin hevur tríggjar partar. Í fyrsta lagi verður positiva løðingin í ringskipanini drigin at negativu løðingini í fosfatbeinagrindini. Spektroskopiskar kanningar vísa, at hesin elektrostatiski parturin er ráðandi við lágum saltinnihaldi, meðan myndlagerð og molekyldynamikkur vísa innskot og binding í smalu foyruni sum støðugar bindingarhættir fyri tvístrongt DNA, sum tikið saman í einari spektroskopiskari kanning av binding millum metylenblátt og DNA. Í øðrum lagi er ein ávísur forkærleiki fyri GC, har myndlagerð vísir fyrimun fyri CpG- og GpC-stig, og royndir vísa helst binding til GC-rík tvístrongd øki í arbeiði um innskotsforkærleikar hjá metylenbláum, men AT-tvístrongd øki binda eisini litievnið. Vanlig liting er ikki raðfylgjusértøk. Í triðja lagi binda einstrongt DNA og RNA fyrst og fremst við elektrostatiskum atdráttarkraftum og stabling við atkomiligar basur og tvístrongd øki. Tí broytist litingarstyrkin við longd, raðfylgju og sekundærbygnaði.

Hetta hevur tvær avleiðingar. Av tí at bindingin er ikki-kovalent, verður litievnið vaska úr. Bond í polyakrylamidi fána skjótt, uttan so at tey verða fest við vilja, og ein serlig mannagongd við varandi festing er til júst tí, at vanlig liting er fyribils, sum lýst av Soto og Draper fyri PAGE-gelir. Av tí at litievnið er ein ljóssensibilisator, kann langvarandi, sterk lýsing av litaðum DNA, tá ið súrevni er til staðar, oxidera guanin og at enda gera brot í einstøkum strongjum. Hesin mekanismurin er nágreiniliga lýstur í arbeiði um guaninoxidatión við metylenbláum sum ljóssensibilisatori. Stuttur avlestur í hvítum ljósi sleppur undan væl kenda UV-skaðanum í klassiskum arbeiðsgongdum við etidiumbromidi, og hetta er ein veruligur fyrimunur, tá ið DNA skal fáast aftur til víðari nýtslu. Sjónligt ljós er mildari, men ikki skaðaleyst. Halt lýsingartíðina stutta, tá ið DNA skal klonast. Les um víðari fotokemisku grundina undir hesum fyrivarni í teimum báðum leiðunum í fotokemi hjá metylenbláum. Les um redoxparið og løðingarstøðurnar, sum greiða frá, hví oxideraða formið bindur og reduséraða formið ikki bindur, í kemini í bygnaði og eginleikum hjá metylenbláum.

Fyrsta uppgáva: liting inni í gelum

Gelliting svarar einum spurningi: er nóg mikið av nukleinsýru í hesum bandinum til, at tað sæst við berum eygum? Tvístrongt DNA í agarosu er best kannaða dømið. Upprunaliga gellitingarmannagongdin við metylenbláum hjá Flores og starvsfeløgum staðfesti skjótu mannagongdina við 0.02 prosent á 1 prosent agarosu og vísti, at tað eydnaðist at fáa DNA aftur og klona tað aftaná. Sama veitaramannagongd er á vørusíðuni hjá IBI Scientific fyri metylenblátt, har membranuppskriftin við 0.04 prosent og skjóta gelmannagongdin standa lið um lið.

Arbeiðsgongd í verki:

1. Koyr gelið sum vanligt. Lita eftir elektroforesu, ikki meðan hon fer fram, uttan so at flyting ella sundurskiljing er staðfest fyri eina broytta mannagongd.
2. Legg gelið í 0.02 prosent w/v metylenblátt í destilleraðum vatni við varligari risting í umleið 15 minuttir.
3. Avlita við fleiri vatnskiftum í umleið 15 minuttir tilsamans, til bakgrundsliturin í matriksini minkar og bondini standa týðiliga fram.
4. Tak mynd beinanvegin á einum lýsitóli við hvítum ljósi.

Agarosa og polyakrylamid bera seg ymiskt at. Agarosa heldur litievni aftur í matriksini, so avlitingin er tað seinføra stigið. Tunn polyakrylamidgelir litast skjótt, men missa eisini litievnið skjótt. Hetta hjálpir, tá ið bond skulu skerast úr til víðari nýtslu, men ger tað torførari at varðveita skrásetingar. Syntetisk oligonukleotid í polyakrylamidi kunnu staðsetast við somu uppskrift við 0.02 prosent eftir 20 til 30 minuttir við endurtiknari vatnskoling, eftir væl etableraðum PAGE-mannagongdum av Current Protocols-slagnum. Frágreiðingar eru um sera tunnar loysnir nær 0.0002 prosent í tunnum TBE til oligonukleotid, sum skulu fáast aftur til víðari nýtslu, yvir fleiri tímar, men próvgrundarlagið er veikari.

Munurin millum DNA og RNA hevur týdning. Tvístrongt DNA gevur sterkastu skipaðu bindingina. RNA og einstrongt DNA litast, men veikari og minni fyrisigiliga. Við formaldehyd-agarosugelum til RNA sleppa flestu rannsóknarstovur bláari liting inni í gelinum og flyta fyrst RNA til eina membran, sum síðan verður litað. Hetta skiftir eitt veikt gelmerki út við eitt týðiligari membranmerki og eina skráseting av lastaðari nøgd.

Onnur uppgáva: liting á membranum

Membranliting svarar einum øðrum spurningi: eydnaðist flytingin, og kunnu gelrásirnar samanberast? Klassiska nýtslan er vendiliga Northern-blotlitingin hjá Herrin og Schmidt, upprunaliga við 0.04 prosent litievni í 50 mM natriumacetati við pH 5.0 í 2 til 3 minuttir og síðan skoling við vatni. Litingin kann takast burtur við tunnum SDS í SSPE undan hybridisering.

Nógv nýtta nútíðarútgávan er soleiðis:

1. Flyt RNA ella denaturerað DNA til nylon ella nitrocellulosu, og fest tað síðan við UV-tværbinding ella hitaviðgerð, so sýnið ikki fer fyri skeytið undir litingini.
2. Valfrítt, men vanligt: væt membranina í 5 prosent edikssýru í umleið 15 minuttir.
3. Lita í 5 til 10 minuttir í 0.02 til 0.04 prosent metylenbláum í 0.3 til 0.5 M natriumacetati nær pH 5.2.
4. Skola og avlita í vatni í 5 til 15 minuttir, skráset úrslitið og tak síðan restina av litievninum burtur undan hybridisering.

Positivt løtt nylon er mest nýtt til Northern-arbeiði. Nitrocellulosa virkar eisini við somu arbeiðsgongd við edikssýru og acetati. Myndin verður brúkt til at staðfesta flyting, samanbera 28S- og 18S-bond (ella 23S og 16S fyri bakteriu-RNA), merkja støddarstigar og standardar og varðveita eina leysliga skráseting til normalisering eftir samlaðari RNA-nøgd. Útgivnar Northern-mannagongdir máta litað ribosomal bond til eftirlit við lastaðari nøgd, millum annað gransking í mjólkurvísindum, sum brúkti ribosomal bond litað við metylenbláum til normalisering. Southern-membranir kunnu gerast sjónligar á sama hátt, men litievnið er nógv betur etablerað til eftirlit við lastaðari nøgd og flyting í Northern. DNA í Southern verður harumframt denaturerað undan flyting, so tøl fyri næmi í gelum kunnu ikki flytast beinleiðis yvir.

Ávísingarmørk og bakgrund: har blátt kemur til stutt

Samanberingin niðanfyri er tilætlað á leið. Úrslitið av litingini veldst um gelprosent, bandbreidd, optikk og nágreiniliga avliting. Met hvørt tal sum eitt støddarstig, ikki sum eitt nágreiniligt krav.

Stýring av bakgrundini avger, um avmarkaða merkið kann brúkast. Frítt litievni hevur sterkan lit, so andstøðan fæst við at taka óbundið litievni burtur uttan at taka bundið litievni við. Sterkari litingarloysn gevur sjáldan størri næmi. Hon leingir fyrst og fremst avlitingartíðina. Koyr eina tynningarrøð á júst tí gelinum, membranini og myndatólinum, sum skulu brúkast, og brúka bert tað økið, har samlaði optiski tettleikin er proportionalur við ísettu nøgdina. Metylenblátt kann brúkast til hálvkvantitativa normalisering av lastaðari nøgd. Tað er ikki ein kvantitativ kanning við víðum dynamiskum øki, tí membrankapasitetur, flytingareffektivitetur, metting og avliting eru ymisk frá rás til rás.

Avmarkingar í sambæriligheit: hvat tolir litingina

Víst er, at kloning eftir bláa liting ber til. Flores og starvsfelagar skóru litað agarosubond úr, fingu DNA aftur og framkvæmdu ligering og transformering. Tey fráboðaðu betri kloning enn eftir etidiumbromid og UV. Mest sannlíka orsøkin er minni ljósskaði, ikki nakar fyrimunur frá sjálvum litievninum. Halt lýsingina við hvítum ljósi stutta, og reinsa endurvunnið DNA við vanligari gelútdráttarreinsing.

Próvgrundarlagið fyri PCR og raðfylgjuáseting er tynri. Leivdir av litievni binda nukleinsýrur, so avlita og reinsa undan enzymatiskum stigum. Væntast kann, at rætt reinsað DNA úr einum bláum geli virkar, men hvussu væl ymiskar polymerasur og ymiskar raðfylgjuásetingarkemiir tola beinleiðis yvirførdar litievnisleivdir, er ikki væl mátað. Rokna ikki við tí.

Blothybridisering er sambærilig, tá ið raðfylgjan verður hildin neyvt: flyt, fest, lita, skráset, avlita, hybridisera. Hetta er raðfylgjan í mannagongdini hjá Herrin og Schmidt. Liting undan flyting, ella at leypa avliting um, er ein onnur mannagongd og krevur sína egnu staðfesting. Eftir at litievnið er tikið burtur, kunnu vanlig burturtøka av probum og nýggj kanning við probum fara fram sum vant. Les um frumuliting við somu litievnisfamilju og um, hví hugsanin aftan fyri fest útstrok ikki kann flytast til mannagongdir við livandi frumum, í atlasinum um liting til mikroskopi.

Úrskering av bondum virkar við agarosu til víðari nýtslu og við PAGE-oligonukleotidum, sum eru staðsett við bláari liting, treytað av at mannagongdin við varandi festing ikki verður brúkt. Elektroeluering eftir avliting er kemiskt sannlík fyri eitt vendiligt bindievni, men lítið er til av stýrdum dátum um úrtøku, sum eru serstakar fyri metylenblátt. Avsalta ella fell út eftir eluering.

Trupulleikar, sum ganga aftur

Veik gelbond merkja vanliga, at ov lítil massi er til eina kolorimetriska liting, serliga við stuttum einstrongdum málsekvensum ella RNA. Lasta meira, brúka frískt litievni, leing litingartíðina áðrenn styrkin verður økt, og steðga avlitingini fyrr. Eitt heilt blátt gel uttan andstøðu merkir vanliga ovliting ella ov fá vatnskifti. Fánandi PAGE-bond eru væntað kemi, ikki miseydnað liting. Tak mynd skjótt. Ójøvn bakgrund á membranini bendir á faldar, bløðrur, fingramerki, ójavna risting ella ójavna flyting. Tulka ikki hetta sum ójavna lastaða nøgd uttan eina eftirlitskanning við hybridisering. Eitt útstrokið, veikt ribosomalt mynstur kann merkja niðurbróting, men eisini ófullfíggjaða flyting, ov lítið samlað RNA (vanligar rásir innihalda fleiri til tíggjutals mikrogramm) ella ov nógva avliting. Litievnið vísir ribosomalt RNA, sum er til staðar í stórum nøgdum. Tað vísir ikki eitt ávíst transkript. Tað er uppgávan hjá probuni.

Trygd og handfaring uttan yvirdrivingar

Metylenblátt er einfaldari at handfara enn etidiumbromid, men tað er ikki skaðaleyst. Eitt núverandi trygdardátublað frá MilliporeSigma flokkar litievnið undir bráðfeingis eiturvirkan við inntøku, kategori 4, skaðiligt at svølgja, og ásetur burturbeining eftir einari góðkendari mannagongd sambært trygdardátublaðnum hjá Sigma-Aldrich fyri metylenblátt. Etidiumbromid hevur strangari ávaringar um genotoksisitet, millum annað illgruna um ávirkan á kynsfrumur í trygdardátublaðnum hjá Sigma-Aldrich fyri etidiumbromid, og gelir og loysnir við tí verða vanliga hildin fyri seg sum vandamikið kemiskt burturkast, sum tilskilað í vegleiðingini hjá Thermo Fisher um litievni til nukleinsýrur. Fylg trygdardátubløðunum og reglunum hjá stovninum fyri bæði. Goym turt litievni turrt og væl afturlatið, endurnýt bert arbeiðsloysnina í tann mun, mannagongdin loyvir, goym litaðar membranir turrar millum filturørk, og tak myndir av gelum, áðrenn bondini spjaðast burtur við diffusjón.

Minst hesa setningin við arbeiðsborðið. Gelir kanna sjónligheit við stórari lastaðari nøgd undir hvítum ljósi. Membranir kanna flyting og lastaða nøgd, áðrenn proban ger tað næma arbeiðið. Eitt litievni røkir báðar uppgávur við avmarkaðum næmi, vendiligari binding og neyvari raðfylgju av arbeiðsstigum.