Máting av reaktivum súrevnisformum í royndum við metylenbláum

Tvær rannsóknarstovur gera tað, sum báðar kalla eina roynd av andoxandi ávirkan hjá metylenbláum. Onnur sigur, at litevnið minkar um reaktivar súrevnisformar. Hin sigur, at tað framleiðir teir. Báðar vísa greiðar skamt-svar-kurvur. Báðar eru erligar. Munurin stavar ikki frá sviki ella vantandi førleika. Hann stavar frá, at bólkarnir mátaðu ymisk viðurskifti undir ymiskum ljósi, við mátingarevnum, sum svara ymiskum spurningum, og síðani lýstu bæði svarini við sama orði: ROS.

Metylenblátt er ein trupul sameind at máta neyvt, tí hon tekur lut í teirri evnafrøði, sum hon skal eygleiða. Í myrkri flytur hon elektrónir millum gevarar og móttakarar og vendir aftur til upprunaliga formin, klár at fara í ringrás aftur. Í ljósi verður hon eitt fotosensibiliserandi evni, sum kemur í ein eksiteraðan triplettstøðufasa. Haðani kann hon flyta orku til súrevni og mynda singlettsúrevni ella flyta elektrónir og mynda radikalar og vetnisperoksid. Eitt og hvørt mátingarevni í hesi skipan kann verða oxiderað, reduserað, bleikt ella optiskt fjalt av sjálvum litevninum. Tí er fyrsti spurningurin við einari ROS-máting ongantíð, hvat talið er. Hann er, hvat mátingin í veruleikanum ávísir, og hvat litevnið ger við mátingina.

Amplex Red: ein kalibrerað máting av vetnisperoksidi

Samansetingin av metylenbláum og Amplex Red er tann samansetingin í hesum bókmentum, sum best kann verjast fakliga, tá ið hon verður sett rætt upp. Evnafrøðin er spesifikk: piparrótperoksidasa nýtir vetnisperoksid til at oxidera Amplex-substratið til eitt fluorescerandi produkt, resorufin, í einum støkiometriskum lutfalli á umleið eitt til eitt. Peroksid úr sýninum verður til fluorescens í detektaranum. Eingin annar av teimum vanligu ROS-formunum drívur hesa reaktión beinleiðis.

Avgerandi fyrimunurin er kalibrering. Ein nærlagdur granskarari mátar kendar peroksidstandardir í sama buffara, við somu styrk av peroksidasu og substrati, somu inkubatiónstíð og somu optisku stillingum, og lesur síðani sýnini av móti hesi kurvu. Í kanningini av avbyrgdum mitokondrium úr heila, sum hesin hátturin byggir á, gjørdu høvundarnir júst hetta. Teir løgdu kendar nøgdir av peroksidi afturat í endanum á hvørjari máting, og tølini eru uppgivin sum ferð í pikomolum um minuttin fyri hvørt milligramm av proteini heldur enn sum tilvildarligar fluorescenseindir. Hetta er tað, sum ger eitt ljós frá sýninum til eina máting.

Trý viðurskifti úr hesi kanning eiga at verða endurtikin. Í fyrsta lagi staðfestu høvundarnir signalið við katalasu, sum brýtur peroksid niður. Vøksturin í fluorescensi, sum metylenblátt elvdi til, steðgaði, tá ið katalasa varð løgd afturat. Hetta váttaði, at signalið stavaði frá peroksidi heldur enn einum optiskum artefakti. Í øðrum lagi kannaðu teir ljóspávirkan beinleiðis við at skugga fyri eksitatiónsgeislanum, so sýnini fingu ein áttandapart av vanliga ljósskammtinum, og signalið minkaði bert níggju prosent. Meira enn níggju tíggjundapartar av peroksidinum, sum teir uppgóvu, vóru óheft av mátingarljósinum. Í triðja lagi mátaðu teir burturbeining av peroksidi fyri seg við einari elektrodu og funnu, at litevnið bæði økti framleiðsluna og seinkaði burturbeiningini. Eitt mátingarevni, sum bert vísir nettofluorescens, hevði blandað hesar báðar ávirkanir saman.

Mátingarhátturin kann tó framvegis svíkja, og metylenblátt útloysir fleiri av hesum veikleikunum. Litevnið absorberar ljós í einum breiðum parti av sama reyða øki, har resorufin sendir ljós út. Við høgum styrkjum av litevninum kann sýnið tí fjala sítt egna signal við innaru filtrarávirkanum. Standardir eiga tí at hava somu styrk av litevninum sum sýnini. Amplex Red kann eisini fotooxiderast av sær sjálvum, og produktið resorufin kann fara í fotoredoksringrás, sum framleiðir superoksid og peroksid. Hetta hevur stóran týdning, tá ið royndin eisini lýsir á eitt fotosensibiliserandi evni. Praktiska loysnin er fyrst at lýsa á sýnini við metylenbláum og síðani máta partar av teimum við Amplex-reagensum í myrkri heldur enn at lýsa á litevni og mátingarevni samstundis. At enda minkar superoksiddismutasa ikki uttan víðari eitt Amplex-signal: umgerðin av superoksidi til peroksid kann økja tað. Ein SOD-kontroll, sum økir fluorescensin, er ikki miseydnað. Hon hevur staðfest superoksid sum ein form fyrr í reaktiónsketuni.

DCFDA: ein óserskildur indikator fyri oxidatión

Samansetingin av metylenbláum og DCFDA er keldan til størsta partin av fløkjuni. DCFH-DA er eitt forevni, sum verður tikið upp í kyknur. Esterasur inni í kyknuni taka acetatbólkarnar av og lata ikki-fluorescerandi DCFH vera eftir. Oxidatión av DCFH gevur fluorescerandi DCF. Listin yvir tað, sum oxiderar tað, er langur: hydroxylradikalar, millumprodukt frá peroksidasu og hemi, nitrogendioksid, hypoklorsýra og radikalar, sum stava frá peroksynitriti. Vetnisperoksid einsamalt oxiderar tað ikki beinleiðis við nakrari nýtiligari ferð. Fluorescens, sum er treytað av peroksidi, krevur vanliga jarn, hemprotein ella peroksidasuevnafrøði í reaktiónsketuni.

Atfinningin, sum hvør háttalýsing eigur at vísa til, stavar frá greiningini hjá Kalyanaraman og starvsfeløgum av DCFH sum mátingarevni, soleiðis sum hon er samanfatað í kanningini av heilamitokondrium, sum av hesi orsøk vrakaði DCFDA. Teir vístu, at litevnið reagerar seint, við ógreinaðari støkiometri, uttan gilda kalibrering og við sambondum, sum ikki eru ROS. Mátingarevnið styrkir eisini tað, sum tað mátar: oxidatión av DCFH við einari elektrón framleiðir ein DCF-radikal, sum reagerar við súrevni og myndar superoksid. Hetta dismuterar til meira peroksid. Mátingin framleiðir sostatt sjálv ein part av teirri evnafrøði, sum hon vísir.

Einki av hesum ger DCFDA ónýtiligt. Tað ger tað til eina screening heldur enn eina eyðmerking. Ein vøkstur í DCF-fluorescensi merkir, at oxidatiónin av mátingarevninum, sum er treytað av oxidantum, øktist. Tað merkir ikki, at peroksid øktist, og tað merkir avgjørt ikki, at samlað ROS øktist, tí einki einstakt mátingarevni mátar hesa nøgd. Eldri kanningar av metylenbláum, sum bygdu á DCF-oxidatión við styrkjum oman fyri eitt mikromolar, vístu prooxiderandi ávirkan, meðan aðrar skipanir í sama tíðarskeiði vístu vernd móti kyknudeyða elvdum av peroksidi. Báðar eygleiðingarnar kunnu vera rættar fyri sama litevni í ymiskum redoksumhvørvum, og DCF-úrslitið einsamalt kann ikki siga, hvør oxidantur bar signalið. Tað týdningarmikla við eldru kanningini av heilamitokondrium er, at hon skifti hesa screening út við eina kalibreraða peroksidmáting og staðfesti álagið beinleiðis: longu eitt hundrað nanomolar av litevninum økti útlátið av peroksidi fleiri ferðir fyri øll substrat og allar respiratiónsstøður, sum vórðu kannað.

DCFDA hevur enn eina fellu, sum er serstøk fyri metylenblátt. Litevnið hevur sterkan lit og er redoksvirkið, so tað kann bleikja fluorescens, sløkkja ljósútsending ella oxidera mátingarevnið óheft av ROS í kyknunum. Ein kontroll uttan kyknur, við litevni og mátingarevni, er ikki valfrí pynt. Hon er royndin, sum sigur tær, um litevnið ávirkar mátingarevnið beinleiðis.

Spinfanging og súrevnisupptøka: eyðmerking og flutningsferð

Har fluorescerandi mátingarevni vísa, at okkurt, sum kann oxiderast, er komið fram, gevur elektrónspinresonans við spinfellum eitt svar, sum kemur nærri tí, hvat tað var. Klassiska kanningin av fotokemi hjá metylenbláum nýtti ESR til at ávísa ascorbatradikalar frá litevni, ascorbati og ljósi. Síðani vísti hon peroksidmynding í royndum við súrevnisupptøku og jarnkatalyseraða mynding av hydroxylradikalum í royndum við spinfanging. Hvør tøkni svaraði tí spurningi, sum hinar ikki kundu svara: ESR gav eyðmerking av radikalum, súrevnisupptøka gav reaktiónsferð óhefta av fluorescerandi mátingarevnum, og samansetingin vísti, at bæði singlettsúrevnisleiðir og radikalleiðir vóru virknar í somu upplýstu skipan.

Úrslitið frá 1984 kann framvegis lesast sum ein ávaring. Tá ið ljós og eitt reduserandi evni vóru til staðar, framleiddi litevnið peroksid. Tá ið jarn eisini var til staðar, framleiddi skipanin hydroxylradikalin, tann mest reaktiva formin í hesum bólki. Høvundarnir settu hetta í samband við ascorbat í eyganum og settu spurnartekin við óumhugsaða nýtslu í eygnaviðgerð. Nútíðar lesarar eiga at leggja til merkis treytirnar: ljós saman við reduserandi evni og jarni. Verður ein teirra tikin burtur, viknar ella hvørvur reaktiónsleiðin.

Súrevniselektrodur hava annað at bjóða. Ein elektroda av Clark-gerð mátar nettosúrevnisnýtslu. Hetta staðfestir, at redoksevnafrøði, sum litevnið drívur, nýtir molekylerað súrevni, og gevur kinetisk úrslit, sum eingin fluorescensartefaktur kann falsa. Hon eyðmerkir ikki produktið. Peroksid, superoksid, vatn og niðurbrot av singlettsúrevni brúka øll súrevni. Flutningsferð uttan eyðmerking er líka ófullfíggjað sum eyðmerking uttan flutningsferð. Tí sameina tær sterku greinarnar elektroduna við eina kalibreraða peroksidmáting ella eina fellu.

Hví úrslit um andoxandi ávirkan eru mótstríðandi

Verða teir tríggir mátingarhættirnir settir lið um lið, kunnu tær eyðsýndu mótsagnirnar í bókmentunum um metylenblátt greiðast við munum í háttalagi saman við trimum lívfrøðiligum viðurskiftum.

Í fyrsta lagi flytur litevnið bæði elektrónir og er ein kelda til peroksid. Við at leiða elektrónir burtur frá teimum støðum í respiratiónsketuni, har súrevni annars hevði verið umgjørt til superoksid, kann tað minka um ein ROS-form. Samstundis reduserar reduseraði formur tess súrevni beinleiðis til peroksid og økir harvið ein annan. Ein rannsóknarstova, sum arbeiðir við redoksevnafrøði í mitokondrium og leiklutinum hjá litevninum sum hjáleið, eigur tí at vænta svar, sum eru treytað av mátingarevninum: eitt úrslit, sum er viðkvæmt fyri superoksidi, lækkar, meðan eitt peroksidúrslit hækkar í somu kyvettu.

Í øðrum lagi er peroksid í lágum skamtum eitt signal, ikki bert ein kelda til skaða. Kanningin av mitokondrium úr músarheila, sum fylgdi eftir eldru kanningini, fann peroksidmynding við so lítlum sum fimmti nanomolar av litevninum uttan skaðar á mitokondriu-DNA við terapeutiskum styrkjum, umframt vernd móti skaðum elvdum av rotenoni eftir undanviðgerð. Bert við eitt hundrað mikromolar, langt oman fyri terapeutiska økið, skaddi litevnið ávís DNA-brot. Reytt ljós saman við tjúgu mikromolar av litevninum framleiddi singlettsúrevni, sum skaddi øll kannaðu brotini. Uppskotna mekanisman er hormetisk: lítil peroksidframleiðsla útloysir andoxandi verju knýtta at Nrf2 og nýmynding av mitokondrium, so eitt prooxiderandi mátiúrslit eftir stutta tíð kemur undan einum andoxandi úrsliti eftir longri tíð. Ein máting eftir ein tíma og ein máting eftir eitt samdøgur kunnu geva ymisk úrslit, tí lívfrøðin broyttist ímillum tær.

Í triðja lagi avger ljós, hvør sameind yvirhøvur er til staðar. Ljóspávirkan tekur metylbólkar av litevninum, so tað verður umgjørt ímóti Azure B og skyldum produktum. Lampan á mikroskopinum oman fyri eina skál er nóg mikið til at gera tað fotovirkið. Royndir í myrkri og royndir í ljósi eru ymiskar royndir, og parturin um kontrollir fyri ljóspávirkan og handfaring av litevni í einari og hvørjari royndarlýsing eigur at viðgera tær soleiðis.

Eitt minstakrav av kontrollum, og hvussu ein og hvør pástandur skal lesast

Samanberingin niðanfyri er upprunaliga tilvísingartilfarið til hesa grein. Áðrenn tú góðtekur nakað ROS-úrslit fyri metylenblátt, kanna, hvørja røð høvundarnir hava fylt út, og hvørja teir hava lopið um.

Úr hesum fæst ein praktisk lesiregla. Kalibrerað Amplex við peroksidasu og einari katalasukontroll er próvtilfar um peroksid. DCFDA er próvtilfar um óserskilda oxidatión av mátingarevninum og einki meira. Spinfanging við kontrollum, sum nýta radikalfangarar, er próvtilfar um eyðmerking av radikalum. Súrevnisupptøka er próvtilfar um flutningsferð. Ein setningur, sum heldur upp á meira, enn mátingarhátturin kann stuðla, er ein setningur um mátingarevnið heldur enn um litevnið, sama hvussu sannførandi hann er orðaður. Skyldar umrøður av skamttreytaðari ávirkan og hormetiska økinum, elektrónflutningi í mitokondrium, mátingarórógvi í litaðum sýnum og artefaktum frá ljóspávirkan í mikroskopi víðka hvørt av hesum sjónarmiðum. Hvørt teirra verður framvegis galdandi, tá ið fyribils tilvísingin verður skift út.