At gera eina kalibreringskurvu fyri metýlenblátt: blankroyndir, øki og linearitetur

Tveir greinandi brúka somu fløsku við stamloysn av metýlenbláum og gera hvør sína kalibreringskurvu. Tann fyrri fær eina beina linju gjøgnum nullpunktið og mátar ókend sýni við vissu. Tann seinni fær eina linju, sum bendir við hægstu konsentratiónirnar, eitt skurðpunkt við y-ásin, sum ikki nærkast nulli, og sýnisúrslit, sum broytast við tynning. Sama litingarevni, sama tól, sama bylgjulongd. Munurin er ikki førleiki. Hann er í tilrættisleggingini: hvat var í blankroyndini, hvørjar konsentratiónir vórðu valdar, og um kannaða økið helt seg innan fyri tað økið, har eitt einfalt modell enn er galdandi.

Ein kalibreringskurva er ein avtala millum tólsvar og konsentratión, sum bert er galdandi undir teimum umstøðum, har kurvan varð gjørd. Fyri metýlenblátt hevur henda avtalan ein kendan veikleika. Litingarevnið savnast í størri eindir í vatni, so tey evnisformini, ið absorbera ljósið, broytast við konsentratiónini. Ein kurva, sum fevnir um hesa broyting, verður ikki bein, og eingin hagfrøði kann rætta tað. Henda greinin vísir, hvussu kurvan kann tilrættisleggjast, so linjan hevur týdning: vel røttu blankroyndina, halt økið innan fyri monomerøkið, ger veruligar endurtøkur, og tulka boging sum upplýsingar heldur enn óljóð.

Byrja við blankroyndini, ikki standardloysnunum

Blankroyndin ásetur null, og fyri metýlenblátt skal hon innihalda alt uttan litingarevnið. Sama vatngóðska, sami buffari og sama pH, somu sølt, sami partur av hjáloysievni og sami hiti. Ger kalibreringsloysnirnar í júst somu matriks. Orsøkin er evnafrøðilig, ikki fyrisitingarlig. Salt og loysingarevni flyta javnvágina millum monomerar, dimerar og størri aggregat, og tað broytir spektrið við mátibylgjulongdina. Ein blankroynd við vatni einum kann ikki rætta eina broyting í býtinum millum evnisformini, sum matriksin elvir til. Í heildargreiningini av spektrum fyri metýlenblátt í vatni, sum er tøk um skrásetingina við opnari atgongd, varð natriumklorid broytt frá 0 til 0.15 M júst tí, at jónastyrkin flytur javnvágina, og aggregatgerð øktist við saltinnihaldinum.

Ein praktisk avleiðing: kalibrera ongantíð í avjónaðum vatni fyri síðani at máta sýni í fosfatbuffara ella filtrati úr spillivatni. Tá eingin matriks uttan analyttin er tøk, er standardtilseting beinleiðis í sýnið betri enn ein ytri kurva við aðrari matriks. Fleiri leiðbeiningar um at tryggja álítandi greiningar í vatnloysnum eru í umrøðuni av matriks og órógvi, og almennu meginreglurnar fyri kvantitativar greiningar av litingarevnum verða viðgjørdar í yvirlitinum um tilrættislegging av greiningum.

Vel eitt øki, har eitt evnisform er ráðandi

Kvantitativ áseting við langbylgjaða bandið nær 664 nm byggir á, at meginparturin av litingarevninum er í monomerformi. Í reinum vatni er henda fortreyt bert galdandi, meðan loysnirnar eru tunnar, umleið í økinum við lágum mikromolarum konsentratiónum. Útgevin hallatøl úr mátingum lýsa markið: kalibreringar, sum verða hildnar undir umleið 7 mikromolar í 1 cm kyvettum, geva eitt hallatal nær 82,000 M-1 cm-1, meðan ein kalibrering, sum verður víðkað upp til umleið 37 mikromolar, fellur niður í umleið 67,100, tí hægstu standardloysnirnar longu innihalda munandi nøgdir av dimerum. Allir koefficientar, sum verða nevndir her, eru merktir við umstøðunum í spektrala tilvísingargrundarlagnum fyri metýlenblátt, sum er rætta staðið at samanbera tøl; henda greinin brúkar teir bert til at áseta økið.

Reglurnar fyri tilrættislegging fylgja beinleiðis av hesum:

1. Halt hægstu standardloysnina nóg tunna til, at skap spektrsins er støðugt. Tá háttalagið verður ment, skalt tú skanna alt sjónliga økið (umleið 550 til 750 nm) fyri hvørt stig heldur enn bert at máta við einari bylgjulongd. Um normaliserað spektrum broyta skap við konsentratiónini, broytist evnafrøðin, og økið er ov vítt.
2. Fylg lutfallinum millum absorbans nær 610 nm og absorbans nær 665 nm á teimum ymisku stigunum. Eitt lutfall, sum hækkar við konsentratiónini, merkir, at dimerskuldurin veksur, og at monomermodellið ikki longur er galdandi. Henda kanningin verður lýst nærri í leiðbeiningini um aggregatgerð og ávirkan av konsentratión.
3. Brúka eina 1 cm kyvettu til arbeiði við lágum mikromolarum konsentratiónum. Við einum hallatali nær 82,000 gevur 5 mikromolar ein absorbans nær 0.41, og 10 mikromolar gevur umleið 0.82, sum bæði liggja væl innan fyri mátimøguleikarnar hjá flestu tólum.
4. Fyri sterkar stamloysnir skalt tú stytta ljósleiðina heldur enn at góðtaka absorbans langt oman fyri 1, men minst til, at ein stutt ljósleið rættar ljósmátingina, ikki evnafrøðina. Aggregatgerð veldst um konsentratión, ikki ljósleiðarlongd, so ein sterk stamloysn krevur framvegis sína egnu viðgerð, sum tekur hædd fyri býtinum millum evnisformini, heldur enn eina kurvu fyri tunnar monomerloysnir.

Heildartillagingin, sum stórur partur av hesi lýsing byggir á, fevndi um 224 spektrum frá 1.1 mikromolar til 3.4 millimolar og vísti, at eitt tetramermerki longu kundi greinast undir 34 mikromolar. Hetta úrslitið vísir, hvussu tú eigur at fara fram: lineera økið er smalari, enn ein intuitivt væntar, so vátta tað heldur enn at taka tað fyri givið.

Stig, endurtøkur og raðfylgja

Ein kurva við trimum punktum prógvar einki. Leiðbeiningarnar um validering í ICH Q2(R2) mæla til minst fimm konsentratiónir fyri at meta um linearitet, og seks til átta stig oman fyri null geva eina meira sannførandi arbeiðskurvu, serliga nær hægsta stiginum, har aggregatgerð byrjar. Být stigini soleiðis, at tey fevna um ætlaða konsentratiónsøkið hjá sýnunum, við fleiri stigum har boging er mest sannlík, heldur enn í einari geometriskari røð, sum er vald av hentleikaávum.

Máta hvørt stig í tveimum ella trimum endurtøkum, sum eru gjørdar hvør sær, heldur enn at máta tríggjar ferðir úr somu fløsku. Sjálvstøðugar endurtøkur avdúka villur í tilgerðini; endurtiknar mátingar úr somu fløsku avdúka bert óljóð frá tólinum. Heildarkanningin frá 2020 mátaði hvørja loysn tríggjar ferðir, og tað er framvegis eitt skilagott útgangsstøði. Vel mátiraðfylgjuna av tilvild, so at rek, adsorptión á glas ella hitabroytingar ikki kunnu tykjast vera boging. Ein kanning við kvartskyvettum vísti, at umleið 3 prosent av litingarevninum úr einari 34 mikromolar loysn vórðu adsorberað innan 10 minuttir, so halt snertitíð, kyvettu, reingerð og raðfylgju samsvarandi gjøgnum alla mátirøðina.

Lýsandi útrokningardømi (ikki mátað dáta)

Tølini niðanfyri eru uppspunnin fyri at vísa útrokningina. Tey eru ikki starvsstovumátingar og mugu ikki verða endurgivin sum dáta fyri metýlenblátt. Tað, sum hevur týdning, er, hvussu eftirlitið kring tey verður skipað.

Hugsa tær seks standardloysnir í sama buffara, við 1 cm ljósleið, mátaðar við 665 nm móti einari samsvarandi blankroynd:

Ein bein linja, sum verður tillagað miðalabsorbansinum sum funktión av konsentratiónini, gevur eitt hallatal nær 0.0805 absorbaanseindir fyri hvønn mikromolar og eitt skurðpunkt við y-ásin, sum liggur innan fyri fáar milliabsorbaanseindir frá nulli. Tá hallatalið verður býtt við ljósleiðarlongdini, verður tað umroknað til ein tilsyniligan absorptivitetskoefficient: 0.0805 fyri hvønn mikromolar svarar til umleið 80,500 M-1 cm-1, sum samsvarar við eitt øki í vatni, har monomerar eru ráðandi. Tað avgerandi eftirlitið er ikki R í øðrum, sum fer at síggja framúr út undir øllum umstøðum. Tað eru skurðpunktið nær nulli, støðuga A610/A665-lutfallið frá S2 til S5 og residualar, sum eru spjaddir uttan nakað mynstur. Lítla hækkingin í lutfallinum við S6 er eitt greitt tekin um annaðhvørt at taka hetta stigið burtur ella at merkja 7 mikromolar sum fyribils ovasta mark fyri hesa samansetingina av matriks og tóli.

Eitt ókent sýni, sum verður mátað til 0.245 undir somu umstøðum, kann umroknast beinleiðis: 0.245 býtt við 0.0805 fyri hvønn mikromolar gevur umleið 3.0 mikromolar, áðrenn nakar tynningarfaktorur fyri sýnið verður nýttur. Skráset úrslitið saman við umstøðunum: bylgjulongd, ljósleið, matriks í blankroyndini, kalibreringsøki og dagfesting.

Kalibreringsarbeiðsark til útfyllingar

Avrita hesa fyrimyndina í starvsstovuskránna fyri hvørja nýggja matriks. Ein matriks, eitt ark, ein kurva.

Røðin um reagensform hevur eina týðandi uppgávu. Metýlenblátt í handli kann vera vatnfrítt salt ella eitt hydrat, til dømis trihydrat, og skeivur molmassi gevur eina óansaða systematiska villu í øllum nominellum konsentratiónum. Kanningar av reinleika og krøvum til útgangsevnið verða viðgjørdar í leiðbeiningini um góðsku og góðskuflokkar.

Vátta við einari sjálvstøðugari eftirlitsstandardloysn

Ein kalibreringskurva eigur ongantíð sjálv at meta um sítt egna arbeiði. Eftir tillagingina skalt tú gera eina eftirlitsstandardloysn úr einari stamloysn, sum er vigað av serstakt, við einari konsentratión nær miðjuni av góðtikna økinum, og máta hana sum eitt ókent sýni. Samsvar innan fyri fá prosent váttar tilgerðarrøðina; eitt frávik bendir á stamloysnina ella tynningarnar heldur enn tólið. Endurtak eftirlitsstandardloysnina við hvørjum sýnisbólki. Um hon rekur, meðan kurvan er óbroytt, skalt tú fyrst hava arbeiðsloysnirnar ella kyvettuna undir illgruna, áðrenn tú setur spurnartekin við sýnini. Henda eina arbeiðsvanan fangar flestu óansaðu villurnar: molmassin hjá einum hydrati verður nýttur til eina fløsku við vatnfríum evni, ein mikropipetta er ikki rætt kalibrerað, ella ein buffari er gjørdur við skeivari jónastyrki. Skráset afturfinningina hjá eftirlitsstandardloysnini á arbeiðsarkið við síðuna av hallatalinum, so ein lesari seinni kann síggja, at linjan varð roynd, ikki bert teknað.

At tulka ólinearitet sum eina greining av orsøkini

Tá kurvan bendir, vísir skapið á frávikinum orsøkina. Boging niðureftir við høgum absorbansi og óbroyttum spektralskapi bendir á tólið, ofta spjatt ljós, sum fær høgan absorbans at verða mátaðan ov lágt. Boging saman við einum vaksandi skuldri við 610 nm bendir á evnafrøðina: dimerar og størri aggregat absorbera øðrvísi enn monomerar. Ein blankroynd, sum ikki kann nullstillast, ella standardloysnir, hvørs absorbans fellur við tíðini, benda á ílatið: adsorptión á glas ella kyvettur, serliga um snertitíðirnar vóru ymiskar gjøgnum mátirøðina. Og ein bein linja gjøgnum punktini, sum kortini gevur skeiv sýnisúrslit, bendir á matriksina: sýnini eru øðrvísi enn kalibreringsloysnirnar, so ger kurvuna av nýggjum í sýnismatriksini ella skift til standardtilseting. Tekna í øllum førum residualar móti konsentratión. Tilvildarlig spjaðing stuðlar modellinum við einari beinari linju; eitt mynstur sum ein bogi upp ella niður afturvísir tað meira álítandi enn nakað mark fyri R í øðrum, eitt sjónarmið, sum leiðbeiningarnar um validering beinleiðis taka undir við.

Metýlenblátt lønir hesum neyvleika. Monomerbandið er sterkt, evnafrøðin er væl kortløgd, og tey ymisku frávikini vísa seg í spektrinum, áðrenn tey skeikla tølini. Halt kurvuøkið smalt, brúka eina rætta blankroynd, ger sjálvstøðugar endurtøkur, og lat skap spektranna avgera økið. Linjan, sum fæst, er stutt, men hvørt punkt á henni er eftirfarandi.

Lýsandi útrokningar í hesi grein brúka uppspunnin tøl til at vísa háttalagið. Mátaðir tilvísingarkoefficientar við øllum umstøðum eru í leinkjaða spektrala tilvísingargrundarlagnum, og undirliggjandi kanningin av aggregatgerð er skrásett undir PMID 33251415.