Uus metüleensinine ja retikulotsüütide värvimine: eraldi värvaine ja elusrakkude meetod

Üliõpilane valmistub retikulotsüütide loendamiseks, tellib metüleensinist, segab seda verega ega näe peaaegu midagi. Kursusekaaslane kasutab pudelit, mille sildil on „uus metüleensinine”, ning näeb osas punalibledes selgeid siniseid niidikesi. Esimene üliõpilane eeldab, et teise pudeli sisu on värskem või kontsentreeritum. Kumbki oletus ei pea paika. Pudel sisaldab teistsugust molekuli.

See mõisteline eksimus põhjustab selles valdkonnas suurema osa segadusest. Nimetus jätab mulje, et uus metüleensinine on metüleensinise täiustatud partii. Keemia näitab muud. Uus metüleensinine N on eraldi fenotiasiinvärvaine, millel on oma Colour Indexi number, oma asendusmuster ja oma standarditud roll hematoloogias. Kui see erinevus on selge, muutub ülejäänud meetod hõlpsasti mõistetavaks: miks peavad rakud värvimise ajal elus olema, mida loetakse retikulotsüüdiks, kuidas sobituvad meetodisse Heinzi kehakesed ja millal tuleb mängu briljantkresüülsinine.

Lühivastus

Hematoloogiareagenti uut metüleensinist N määratletakse üldjuhul kui Basic Blue 24, nagu on kirjas PubChemi uue metüleensinise kirjes, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, valem C18H22ClN3S. Tavaline metüleensinine on metüültioniiniumkloriid ehk Basic Blue 9, nagu on kirjas selle PubChemi kirjes, C.I. 52015, CAS 61-73-4, valem C16H18ClN3S. Struktuurilt on uuel metüleensinisel kaks tsükliga seotud metüülrühma ja etüülaminokülgahelad, samas kui metüleensinisel on dimetüülaminorühmad. See erinevus muudab värvimisomadusi. Hematoloogiaõpikud kirjeldavad tavalist metüleensinist suhteliselt kehva retikulotsüütide värvainena ning uut metüleensinist tugevama ja ühtlasema värvumise andjana; selle võrdluse võtab kokku ScienceDirecti uue metüleensinise teemakäsitlus.

Jah, uus metüleensinine on supravitaalne värvaine. Supravitaalne värvimine tähendab elusrakkude värvimist pärast nende eemaldamist organismist ja enne fikseerimist, nagu määratletakse NCBI ülevaates supravitaalse värvimise põhimõtetest. Sellesse kategooriasse kuuluvad nii uus metüleensinine kui ka briljantkresüülsinine ning CLSI retikulotsüütide standard käsitleb uut metüleensinist sõnaselgelt supravitaalse värvainena. Üliõpilased liigitavad selle vahel mõttes kokku fikseeritud äigepreparaatide Romanowsky värvimisega. See arusaam siin ei toimi. Kui fikseerida kõigepealt, lakkab meetod toimimast.

Lugejatele, kes jälgivad sarnaseid värvainenimetusi, käsitleb metüülsinise ja metüleensinise võrdlus teistsugust ja ulatuslikumat segiajamist anioonse triarüülmetaanvärvaine ning katioonsete fenotiasiinide perekonna vahel. Laboratoorse värvimise ülevaade paigutab supravitaalse töö fikseeritud äigepreparaatide meetodite kõrvale ning vererakkude morfoloogia juhend näitab, kuhu retikulotsüütide hindamine laiemas diferentseeritud vererakkude hindamises sobitub.

Üks hoiatus kataloogide kohta: uuest metüleensinisest on olemas eraldi tsinkkloriidi kaksiksoola vorm CAS-numbriga 6586-05-6. Seetõttu tuleks meetodite jaotises nimetada soolavorm ja tarnija, mitte ainult üldnimetus.

Mida supravitaalne värvimine tegelikult teeb

Retikulotsüüt on noor punalible, mis on kaotanud tuuma, kuid sisaldab veel ribosomaalse RNA jääke. Värvimata märgpreparaadis on see RNA nähtamatu. Supravitaalne värvaine siseneb elusrakku ning sadestab või koondab RNA sinisteks graanuliteks ja niidikesteks: õliimmersiooniga nähtavaks retikulofilamentseks materjaliks. Võrgustik on seega värvimise tulemus, mitte eelnevalt olemas olnud skelett, mis ootab värvi. Seetõttu on protokolli muutujad — värvaine kontsentratsioon, puhver, vere ja värvaine suhe, temperatuur ning aeg — sama olulised kui värvaine nimetus.

Praktiline järeldus on range toimingute järjekord: kõigepealt segatakse antikoagulandiga veri värvainega, inkubeeritakse ning seejärel valmistatakse äigepreparaadid, mida uuritakse fikseerimata ja kontrastvärvimiseta. Fikseerimine enne värvimist või nõrku niidikesi varjav kontrastvärvimine hävitab teabe, millel loendus põhineb.

Retikulotsüütide toimiv värvimisprotokoll uue metüleensinisega

Üht universaalset koostist ei ole, seega tuleb kasutatud koostis ära märkida. Kolm dokumenteeritud varianti näitavad võimaluste ulatust.

Klassikalises Brecheri tüüpi protseduuris kasutatakse ligikaudu 0.5 protsenti uut metüleensinist koos kaaliumoksalaadiga, segatakse see võrdsetes mahtudes hästi segatud EDTA-verega ning inkubeeritakse toatemperatuuril umbes 10 kuni 15 minutit. Pärast õrna uuesti segamist valmistatakse õhukesed kiilukujulised äigepreparaadid, kuivatatakse need õhu käes ning uuritakse fikseerimata kujul 100x õliimmersioonobjektiiviga. NCBI retikulotsüütide loendamise protseduur kirjeldab seda töövoogu ja selle juures kasutatavat loendusraami.

Dacie ja Lewise variandis kasutatakse 1.0 protsenti uut metüleensinist tsitraati sisaldavas soolalahuses, segatakse see 2 kuni 4 mahuosaga verega ning hoitakse enne äigepreparaatide valmistamist temperatuuril 37 C 15 kuni 20 minutit. Hiljutises CLSI H44 protseduuri ühtlustamise rakenduses kasutati lahjemat, 0.1-protsendilist lahust fosfaatpuhverdatud soolalahuses pH-ga 7.4, inkubeerides temperatuuril 20 C 10 minutit ja fikseerimata, nagu kirjeldati 2026. aasta NMB ühtlustamise uuringus.

Loendusreeglid on kõigis variantides samad. Rakk loetakse retikulotsüüdiks, kui see sisaldab vähemalt kahte eraldi siniseks värvunud graanulit või niidikeselõiku; nii välistatakse üksik värvaine sade. Rutiinses töös loendatakse vähemalt 1,000 punaliblet ja esitatakse retikulotsüütide osakaal protsendina. Väikese osakaalu korral nõuab statistika suuremat rakkude arvu. CLSI H44 metoodika ülevaates märgitakse, et ligikaudu 1-protsendilise retikulotsüütide osakaalu juures on loenduse varieeruvuse vähendamiseks 5 protsendini vaja umbes 4,400 rakku; seda käsitleb De Gruyteri CLSI H44 ülevaade. Milleri okulaariketas muudab suuremahulise loendamise praktiliselt teostatavaks. Värvaine tuleb filtreerida või värskelt valmistada, sest sade jäljendab granulaarseid inklusioone.

Heinzi kehakesed samas preparaadis

Sama supravitaalne äigepreparaat võib näidata ka Heinzi kehakesi, mis on oksüdeerunud ja denatureerunud hemoglobiini kogumikud, mitte RNA jäägid. Uue metüleensinisega valmistatud preparaatides paistavad need ümarate kehakestena, sageli üksikuna ja membraani lähedal, ning värvuvad retikulofilamentsest materjalist heledamaks siniseks. Need säilivad fikseerimisel ja kontrastvärvimisel halvasti, seega tuleb uurida fikseerimata äigepreparaati. Hiljutises protokollis kasutati 20 mikroliitrit EDTA-verd koos 20 mikroliitri 1-protsendilise uue metüleensinisega ja 15-minutilist inkubeerimist ning määrati Heinzi kehakestega rakkude osakaal 250 erütrotsüüdi hulgas; seda kirjeldab vastavat protseduuri käsitlev PMC uuring.

Kaks eristust aitavad valesti tõlgendamist vältida. Esiteks värvivad metüülviolett ja kristallviolett Heinzi kehakesi intensiivsemalt kui uus metüleensinine, nagu märgitakse ScienceDirecti Heinzi kehakeste teemakäsitluses. Uus metüleensinine on mugav valik siis, kui retikulotsüüte ja Heinzi kehakesi hinnatakse koos, kuid see ei ole kõige tugevam spetsiaalselt Heinzi kehakeste jaoks mõeldud värvaine. Teiseks tekitavad HbH inklusioonid alfa-talasseemia kandluse korral pärast supravitaalset värvimist kogu rakus hulgaliselt peeneid täppe, samas kui klassikalisi Heinzi kehakesi on vähem, need on suuremad ja sageli membraaniga seotud. Kolmas sarnase välimusega nähtus on värvaine sade: see asub väljaspool rakkude fookustasandit ja varieerub vaateväljade vahel.

Briljantkresüülsinine võrreldes uue metüleensinisega

Mõlemad värvained sobivad retikulotsüütide supravitaalseks värvimiseks, kuid standardimine eelistab neist ühte. CLSI H44-A2 retikulotsüütide meetod, mis töötati välja koos rahvusvahelise hematoloogia standardimise nõukoguga ja on esitatud CLSI H44 standardi lehel, määratleb manuaalse võrdlusmeetodina EDTA-vere värvimise uue metüleensinisega. Klassikaline hematoloogiaõpetus on välimuse osas samal seisukohal: uus metüleensinine annab niidikestele tugevama ja ühtlasema värvumise, samas kui briljantkresüülsinise tulemus varieerub partiide ja proovide vahel rohkem.

See staatus vajab täpsustust. ICSH analüsaatorite hindamise juhend aktsepteerib uue metüleensinisega manuaalset mikroskoopiat võrdlusalusena, kuid nimetab seda subjektiivseks ja suhteliselt ebatäpseks ning eelistab võimaluse korral voolutsütomeetrilisi referentsprotseduure. 2022. aasta 100 proovi võrdluses leiti, et briljantkresüülsinise süstemaatiline kõrvalekalle kasutatud analüsaatori suhtes oli väiksem kui uue metüleensinise oma; sellest teatati PMC värvimismeetodite võrdluses. Üliõpilastele sobiv põhjendatud kokkuvõte on järgmine: kasutage uut metüleensinist standarditud manuaalse võrdlusvahendina, kontrollige iga kohalikku briljantkresüülsinise meetodit selle või automatiseeritud meetodi suhtes ning arvestage manuaalse mikroskoopia puhul mõlemal juhul suurema tulemuste hajuvusega. Varasem standardimiskirjandus pooldas ka puhastatud Azure B kasutamist keemiliselt puhtama alternatiivina, sest kaubanduslikud värvainepartiid varieerusid; seda käsitleb Marshalli uuring Azure B kohta. See selgitab, miks reagendi puhtusaste meetodite aruteludes endiselt esile tuleb.

Tüüpiliste vigade vältimine

Neli viga põhjustavad enamiku ebaõnnestunud preparaatidest. Tavalise metüleensinise tellimine uue metüleensinise N asemel annab nõrga värvumise keemilistel põhjustel, mitte tehnika tõttu. Fikseerimine või kontrastvärvimine enne hindamist eemaldab supravitaalse signaali. Värvaine sademe lugemine graanuliteks suurendab tulemust; seda aitavad vältida kahe graanuli reegel ja filtreeritud värvaine. Liiga väheste rakkude loendamine väikese retikulotsüütide osakaalu korral annab täpse välimusega arvu, mille usalduspiirid on laiad. Kõigil neil vigadel on sama tunnus: mikroskopist süüdistab mikroskoopi tulemuses, mille määras reagendi kasutamise etapp.