Reaktiivsete hapnikuühendite mõõtmine metüleensinise katsetes

Kaks laborit teevad katse, mida mõlemad nimetavad metüleensinise antioksüdantsuse katseks. Üks teatab, et värvaine pärsib reaktiivseid hapnikuühendeid. Teine teatab, et see tekitab neid. Mõlemad näitavad selgeid annuse-vastuse kõveraid. Mõlemad on siirad. Erinevuse põhjus ei ole pettus ega ebapädevus. Kaks rühma mõõtsid eri asju erineva valgustuse all, kasutades sonde, mis vastavad erinevatele küsimustele, ning nimetasid seejärel mõlemat tulemust sama sõnaga: ROS.

Metüleensinine on molekul, mida on raske täpselt mõõta, sest see osaleb keemilistes protsessides, mida peaks vaatlema. Pimedas vahendab see elektrone doonorite ja aktseptorite vahel ning naaseb algvormi, olles valmis järgmiseks tsükliks. Valguse käes muutub see fotosensibilisaatoriks, jõudes ergastatud triplett-olekusse, millest saab anda hapnikule energiat singlett-hapniku tekitamiseks või üle kanda elektrone radikaalide ja vesinikperoksiidi moodustamiseks. Iga sellesse süsteemi lisatud sond võib värvaine enda toimel oksüdeeruda, redutseeruda, pleekida või optiliselt varjatuks jääda. Seega ei ole ühegi ROS-i mõõtmise puhul esimene küsimus kunagi see, milline on arvuline tulemus. Küsimus on selles, mida analüüs tegelikult tuvastab ja kuidas värvaine analüüsi mõjutab.

Amplex Red: kalibreeritud vesinikperoksiidianalüüs

Metüleensinise ja Amplex Redi kombinatsioon on selle valdkonna kirjanduses kõige paremini põhjendatav valik, kui katse on õigesti korraldatud. Keemiline reaktsioon on spetsiifiline: mädarõika peroksüdaas kasutab vesinikperoksiidi, et oksüdeerida Amplexi substraat fluorestseeruvaks saaduseks resorufiiniks ligikaudu üks ühele stöhhiomeetrilises suhtes. Proovis olev peroksiid väljendub detektoris fluorestsentsina. Ükski teine tavapärasesse ROS-i rühma kuuluv ühend seda reaktsiooni otseselt ei käivita.

Otsustav eelis on kalibreerimine. Hoolikas uurija mõõdab teadaoleva peroksiidisisaldusega standardlahuseid samas puhvris, samade peroksüdaasi- ja substraadikontsentratsioonide, sama inkubatsiooniaja ning samade optiliste seadistustega ja võrdleb seejärel proove saadud kõveraga. Selle meetodi aluseks olevas isoleeritud ajumitokondrite uuringus tegid autorid just seda, lisades iga katseseeria lõpus teadaoleva koguse peroksiidi. Tulemused esitati kiirustena pikomoolides minutis valgu milligrammi kohta, mitte suvaliste fluorestsentsiühikutena. Just see muudab helenduse mõõtmiseks.

Kolm selle uuringu üksikasja väärivad järgimist. Esiteks kontrollisid autorid signaali katalaasiga, mis lagundab peroksiidi. Metüleensinisest tingitud fluorestsentsi suurenemine peatus katalaasi lisamisel, kinnitades, et signaal pärines peroksiidist, mitte optilisest artefaktist. Teiseks kontrollisid nad valgustuse mõju otse, piirates ergastuskiirt katikuga nii, et proovid said ühe kaheksandiku tavalisest valgusdoosist, ning signaal vähenes vaid üheksa protsenti. Üle üheksakümne protsendi nende mõõdetud peroksiidist ei sõltunud mõõtmisel kasutatud valgusest. Kolmandaks mõõtsid nad peroksiidi eemaldamist eraldi elektroodiga ja leidsid, et värvaine nii suurendas selle teket kui ka aeglustas eemaldamist. Sond, mis näitab ainult summaarset fluorestsentsi, oleks need kaks mõju ühte tulemusnäitu koondanud.

Analüüsil on siiski nõrku kohti ja metüleensinine toob neist mitu esile. Värvaine neelab valgust laias vahemikus samas spektri punases piirkonnas, kus resorufiin kiirgab. Seetõttu võib proov suure värvainekontsentratsiooni korral sisefiltriefekti tõttu omaenda signaali varjata. Standardlahused peaksid seega sisaldama sama värvainekontsentratsiooni kui proovid. Amplex Red võib ka iseseisvalt fotooksüdeeruda ning selle saadus resorufiin võib osaleda fotoredokstsüklis, mis tekitab superoksiidi ja peroksiidi. See on eriti oluline, kui katses valgustatakse ka fotosensibilisaatorit. Praktiline lahendus on esmalt kiiritada metüleensinise proove ja seejärel analüüsida alikvoote Amplexi reagentidega pimedas, mitte valgustada värvainet ja sondi koos. Lõpuks ei pärsi superoksiidi dismutaas lihtsalt Amplexi signaali: superoksiidi muundamine peroksiidiks võib seda suurendada. SOD-kontrollkatse, mis suurendab fluorestsentsi, ei ole ebaõnnestunud. See on tuvastanud superoksiidi reaktsiooniraja varasema osalisena.

DCFDA: mittespetsiifiline oksüdatsiooniindikaator

Metüleensinise ja DCFDA kombinatsioon on enamiku segaduste allikas. DCFH-DA on eelaine, mille abil viiakse sond rakkudesse. Rakusisesed esteraasid eemaldavad selle atsetaatrühmad, jättes alles mittefluorestseeruva DCFH, mille oksüdeerumisel tekib fluorestseeruv DCF. Seda oksüdeerivate ainete loetelu on pikk: hüdroksüülradikaalid, peroksüdaasi ja heemi vaheühendid, lämmastikdioksiid, hüpokloorishape ning peroksünitritist pärinevad radikaalid. Vesinikperoksiid üksi ei oksüdeeri seda otseselt ühegi praktiliselt kasuliku kiirusega; peroksiidist sõltuv fluorestsents eeldab üldjuhul raua, heemvalkude või peroksüdaasireaktsioonide osalust.

Kriitiline käsitlus, millele iga meetodite jaotis peaks viitama, pärineb Kalyanaramani ja kolleegide DCFH kui sondi analüüsist. Nagu on kokku võetud ajumitokondrite uuringus, kus DCFDA just sel põhjusel kõrvale jäeti, näitasid nad, et sond reageerib aeglaselt, selle stöhhiomeetria on kirjeldamata, puudub usaldusväärne kalibreerimine ning see reageerib ka ühenditega, mis ei kuulu ROS-i hulka. Sond võimendab ka seda, mida mõõdab: DCFH üheelektroniline oksüdeerumine tekitab DCF-radikaali, mis reageerib hapnikuga ja moodustab superoksiidi, mille dismutatsioonil tekib täiendav peroksiid. Mõõtmine tekitab osaliselt ise keemilised protsessid, mida see näitab.

See kõik ei muuda DCFDA-d kasutuks. See teeb sellest sõelmeetodi, mitte tuvastusmeetodi. DCF-i fluorestsentsi suurenemine tähendab, et oksüdantidest sõltuv sondi oksüdeerumine suurenes. See ei tähenda, et peroksiidi hulk suurenes, ega kindlasti mitte seda, et suurenes ROS-i koguhulk, mida ükski üksik sond ei mõõda. Varasemad metüleensinise uuringud, mis tuginesid DCF-i oksüdatsioonile üle ühe mikromolaarse kontsentratsiooni juures, teatasid prooksüdantsetest mõjudest, samas kui teised sama ajajärgu katsesüsteemid näitasid kaitset peroksiidist põhjustatud rakusurma eest. Mõlemad tähelepanekud võivad sama värvaine puhul erinevates redokstingimustes tõele vastata ning DCF-i tulemus üksi ei näita, milline oksüdant signaali tekitas. Varasema ajumitokondrite uuringu tähtsus seisneb selles, et sõelmeetod asendati kalibreeritud peroksiidimõõtmisega ja koormus tuvastati otseselt: juba saja nanomolaarne värvainekontsentratsioon suurendas peroksiidi vabanemist mitu korda kõigi katsetatud substraatide ja hingamisseisundite korral.

DCFDA puhul on veel üks metüleensinisele omane lõks. Värvaine on intensiivse värvusega ja redoksaktiivne, mistõttu võib see fluorestsentsi pleegitada, emissiooni kustutada või sondi oksüdeerida sõltumatult rakulisest ROS-ist. Rakuvaba kontrollkatse värvaine ja sondiga, kuid ilma rakkudeta, ei ole valikuline kaunistus. See katse näitab, kas värvaine mõjutab sondi.

Spinni püüdmine ja hapnikutarbimine: tuvastamine ja reaktsioonivoog

Kui fluorestseeruvad sondid näitavad, et tekkis midagi oksüdeerimisvõimelist, siis elektronspinnresonants koos spinnipüüduritega annab parema ettekujutuse sellest, mis see oli. Klassikalises metüleensinise fotokeemia uuringus kasutati ESR-i askorbaatradikaali tuvastamiseks värvaine, askorbaadi ja valguse koostoimel. Seejärel näidati hapnikutarbimise katsetes peroksiidi teket ning spinni püüdmise katsetes raua katalüüsitud hüdroksüülradikaalide teket. Iga meetod vastas küsimusele, millele teised vastata ei saanud: ESR tuvastas radikaali, hapnikutarbimine näitas reaktsioonivoogu sõltumatult fluorestseeruvatest sondidest ning nende kombinatsioon näitas, et samas valgustatud süsteemis toimisid nii singlett-hapniku kui ka radikaalide reaktsioonirajad.

See 1984. aasta tulemus mõjub endiselt hoiatussildina. Valgustuse ja redutseeriva aine olemasolul tekitas värvaine peroksiidi ning raua juuresolekul tootis süsteem hüdroksüülradikaali, selle rühma kõige reaktsioonivõimelisemat osakest. Autorid seostasid seda silmas leiduva askorbaadiga ja seadsid kahtluse alla läbimõtlematu kasutamise oftalmoloogias. Tänapäeva lugeja peaks tähele panema tingimusi: valgus koos redutseerija ja rauaga. Kui üks neist eemaldada, siis reaktsioonirada nõrgeneb või kaob.

Hapnikuelektroodide väärtus seisneb muus. Clarki tüüpi elektrood mõõdab summaarset hapnikutarbimist, mis kinnitab, et värvaine käivitatud redoksreaktsioonid tarbivad molekulaarset hapnikku, ning annab kineetikaandmeid, mida ükski fluorestsentsi artefakt ei saa võltsida. See ei tuvasta saadust. Peroksiidi, superoksiidi ja vee moodustumine ning singlett-hapniku lagunemine võivad kõik hõlmata hapnikutarbimist. Reaktsioonivoog ilma osakeste tuvastamiseta on sama puudulik kui osakeste tuvastamine ilma reaktsioonivoo mõõtmiseta. Seetõttu ühendavad tugevad uurimused elektroodimõõtmise kalibreeritud peroksiidianalüüsi või püüduriga.

Miks antioksüdantsuse tulemused on vastuolulised

Kui asetada need kolm mõõtmisviisi kõrvuti, taanduvad metüleensinise kirjanduse näilised vastuolud meetodierinevustele ja kolmele bioloogilisele tõsiasjale.

Esiteks on värvaine nii elektronide vahendaja kui ka peroksiidi allikas. Juhtides elektrone kõrvale hingamisahela kohtadest, kus hapnik muutuks muidu superoksiidiks, võib see vähendada ühe ROS-i hulka, samal ajal kui selle redutseeritud vorm redutseerib hapniku otse peroksiidiks ja suurendab teise hulka. Labor, mis tegeleb mitokondriaalse redokskeemia ja metüleensinise möödaviiva rolliga, peaks seega ootama sondist sõltuvaid tulemusi: samas küvetis väheneb superoksiidi suhtes tundliku mõõtmise näit, samal ajal kui peroksiidi näit suureneb.

Teiseks toimib peroksiid väikestes annustes signaalina, mitte üksnes kahjustajana. Varasemale tööle järgnenud hiire ajumitokondrite uuringus leiti peroksiidi teke juba viiekümne nanomolaarse värvainekontsentratsiooni juures, ilma mitokondriaalse DNA kahjustusteta terapeutilisel tasemel, ning eeltöötluse järel kaitse rotenoonist põhjustatud kahjustuste eest. Alles saja mikromolaarse kontsentratsiooni juures, mis ületas terapeutilist vahemikku kaugelt, kahjustas värvaine valitud DNA-fragmente. Punane valgus koos kahekümne mikromolaarse värvainekontsentratsiooniga tekitas aga singlett-hapnikku, mis kahjustas kõiki uuritud fragmente. Pakutud mehhanism on hormeetiline: peroksiidi mõõdukas teke käivitab Nrf2-ga seotud antioksüdantsed kaitsemehhanismid ja mitokondrite biogeneesi, nii et lühiajaline prooksüdantne näit eelneb pikemaajalisele antioksüdantsele tulemusele. Ühe tunni järel ja ühe päeva järel loetud analüüsitulemused võivad erineda, sest bioloogia on vahepeal muutunud.

Kolmandaks määrab valgus, milline molekul üldse olemas on. Valgustus demetüleerib värvainet, tekitades Azure B-d ja sellega seotud saadusi, ning juba mikroskoobilambist kultuurinõu kohal piisab selle fotosensibiliseerimiseks. Pimedas ja valguse käes tehtud katsed on erinevad katsed ning iga protokolli valgustuse ja värvaine käsitsemise kontrollkatsete jaotis peaks neid sellisena käsitlema.

Minimaalne kontrollkatsete komplekt ja väidete tõlgendamine

Allolev võrdlus on selle artikli jaoks koostatud algupärane võrdlusmaterjal. Enne mis tahes metüleensinise ROS-i tulemuse omaksvõtmist kontrolli, millise rea autorid täitsid ja millise vahele jätsid.

Sellest tuleneb praktiline tõlgendusreegel. Kalibreeritud Amplex koos peroksüdaasi ja katalaasikontrolliga annab tõendeid peroksiidi kohta. DCFDA annab tõendeid sondi mittespetsiifilise oksüdatsiooni kohta ja mitte midagi enamat. Spinni püüdmine koos radikaalipüüdjate kontrollkatsetega annab tõendeid radikaali olemuse kohta. Hapnikutarbimine annab tõendeid reaktsioonivoo kohta. Lause, mis väidab rohkem, kui selle aluseks olev analüüs toetab, räägib sondist, mitte värvainest, ükskõik kui enesekindlalt see on kirjutatud. Seotud käsitlused annusesõltuvusest ja hormeetilisest vahemikust, mitokondriaalsest elektronivoost, analüüsihäiretest värvitud proovides ning mikroskoopia valgustusartefaktidest täiendavad kõiki neid punkte, ja igaüks neist jääb kehtima ka pärast kohatäitena kasutatud viite asendamist.