Põserakkude värvimine metüleensinisega: mida vaadelda

Õpilane asetab tilga põserakkude suspensiooni alusklaasile, vaatab mikroskoopi ja ei näe peaaegu midagi. Heledas vaateväljas triivivad mõned kahvatud varjud. Ta reguleerib fookust, suurendab seejärel valgust ja järeldab lõpuks, et alusklaas on tühi. Alusklaas ei ole tühi. Rakud on olemas. Need on peaaegu läbipaistvad ning just läbipaistvus on probleem, mille lahendamiseks seda värvingut kasutatakse.

Seda ootuse ja pildi lahknevust tasub selgitada enne tööjuhendi juurde asumist. Algajad ootavad, et mikroskoop tooks detailid nähtavale samamoodi nagu kaamera suum kauge sildi. Heleväljamikroskoop teeb midagi piiratumat: see näitab valguse neeldumise erinevusi. Värvimata põserakk ei neela peaaegu üldse valgust, mistõttu ei tekita see ka peaaegu mingit erinevust. Metüleensinine lisab selle erinevuse. See seondub raku sees ebaühtlaselt ja muudab struktuuri kontrastiks. Kui õpilased sellest põhimõttest aru saavad, muutub iga järgnev samm loogiliseks tagajärjeks, mitte lihtsalt retsepti osaks.

Siin on abiks taustateadmised selle kohta, kuidas lihtvärvingud koolilaboris kontrasti lisavad, ning heleväljamikroskoobi seadistamise meeldetuletus enne värvimist aitab ära hoida pooled ebaõnnestunud preparaadid. Värvuse keemilist tausta käsitleb sissejuhatus metüleensinise kasutamisse mikroskoopias, mis selgitab, miks just see värvaine ikka ja jälle laborilauale jõuab.

Õppetöö juhend

Allpool kirjeldatud märgpreparaat on tavapäraseks õppetööks lihtsam valik. See ei vaja leeki ega fikseerimist. Mõnes kõrgkooli juhendis kasutatav fikseeritud äigepreparaat hõlmab lisaks õhu käes kuivatamist ja lühikest kuumfikseerimist, nagu North Central Texas College’i põserakkude äigepreparaadi ülesandes, mis on avaldatud Biology LibreTextsi kaudu, kuid kuumfikseerimine on mikrobioloogias levinud võte, mitte epiteelrakkude nägemise eeltingimus.

Vajalikud vahendid: puhtad alus- ja katteklaasid, steriilsed ühekordsed proovivõtutampoonid (eelistatud) või uued lamedad hambaorgid, tilgutipudel 0.5 kuni 1 protsendi metüleensinise vesilahusega, destilleeritud või deioniseeritud vesi, kuivatuspaber, kindad ning liitmikroskoop kogusuurendustega 100x ja 400x.

1. Loputa suud puhta veega. See eemaldab toiduosakesed, mis muidu hiljem tugevalt värvuvad ja rakkudelt tähelepanu kõrvale juhivad.
2. Iga õpilane võtab proovi ainult enda põselt. Hõõru põse sisekülge õrnalt uue steriilse tampooniga. Vajuta, ära kraabi. Lõpeta ammu enne ebamugavustunde või verejooksu tekkimist.
3. Veereta tampooni üle puhta alusklaasi keskosa, jättes sellele õhukese kihi. Õhuke kiht on selgelt vaadeldava preparaadi kõige olulisem eeldus. Paks valge kogum värvub eristamatuks siniseks massiks.
4. Lisa äigele üks tilk metüleensinist. Lase mõjuda 1 kuni 3 minutit. Paljudes kõrgkoolide juhendites piisab ühest minutist; NCERT-i IX klassi loodusteaduste laborijuhendis kasutatakse ajutise preparaadi puhul umbes 3 minutit. Pikem aeg ei ole parem ning ülevärvimine on kõige tavalisem ajastamisviga.
5. Loputa õrnalt destilleeritud veega või eemalda liigne värvaine kuivatuspaberiga, järgides kohalikku tööjuhendit. Taust peaks muutuma kahvatusiniseks, mitte sügavaks tumesiniseks.
6. Langeta katteklaas nurga all nii, et üks serv puudutab preparaati esimesena, seejärel lase klaasil aeglaselt alla vajuda. Nii väldid õhumulle.
7. Alusta väikese suurendusega, et rakud üles leida, kontrolli fookust ja tsentreeritust ning liigu seejärel suurendusele 100x ja lõpuks 400x. Suurendusel 400x kasuta ainult peenfookust.

Värvaine kontsentratsioon vajab üht täpsustavat lauset. Koolide tööjuhendites kasutatakse enamasti 1 protsendi metüleensinise vesilahust. Kangem lähtelahus või pikem mõjuaeg muudab tausta tumedamaks kiiremini kui tuuma, pöörates nii ümber kontrasti, millel ülesanne põhineb.

Põselt võetud materjali ohutu käsitsemine

Põseproovid sisaldavad sülge ja suu tavapäraseid mikroorganisme, seega käsitle iga värsket äigepreparaati potentsiaalselt nakkusohtliku materjalina, kuigi proovide andjad on terved klassikaaslased. Ameerika Mikrobioloogia Seltsi bioohutusjuhised õppelaboritele sätestavad üldpõhimõtted: hinda riske enne tundi, kanna kindaid, kaitse silmi pritsmeohu korral, pese pärast käsi, desinfitseeri tööpinnad ning kõrvalda saastunud ühekordsed vahendid heakskiidetud bioloogiliste jäätmete käitluskorra järgi.

Neli klassireeglit aitavad maandada suurema osa riskist. Üks proovivõtja tampooni ja alusklaasi kohta; neid ei jagata kunagi. Proov võetakse ainult endalt, mitte kunagi naabrilt. Ühekordsed tampoonid ja hambaorgid lähevad otse ettenähtud jäätmemahutisse, mitte tagasi töölauale. Metüleensinine ise määrib nahka ja riideid ning ärritab silmi, seega tuleb kanda kindaid ja järgida tavapäraseid värvainetega töötamise hügieenireegleid. Ära laiendage seda ülesannet äigepreparaadist pärit materjali kultiveerimisele ega improviseerige värske inimmaterjali kuumfikseerimist väljaspool kooli ohutusjuhiseid.

Mida vaadelda ja miks see nii välja näeb

Suurendusel 100x otsi laiu lamedaid kahvatusiniseid rakke, mille piirjooned on ebakorrapäraselt ovaalsed või hulknurksed. Need paiknevad üksikult või hõredate kattuvate kihtidena. Igas rakus on tavaliselt üks tumedam sinine täpp. See täpp on rakutuum. Pane tähele ka paigutust: lameepiteelirakud on õhukesed plaadikesed, mitte kerad, mistõttu meenutavad nende servad pigem pragunenud glasuuri kui ümmargusi õhupalle.

Suurendusel 400x eristuvad selgelt kolm tunnust. Raku piir ilmub peene tumedama joonena, mis ümbritseb rakku. Tsütoplasma täidab raku sisemuse heleda ühtlase sinisega. Tuum on tumedam ja kompaktsem, sageli ovaalne ning tavaliselt keskosa lähedal, kuid mitte alati. Palu õpilastel üles märkida kõik kolm tunnust ning lisaks kuju ja suurendus, sest tööleht küsib just neid.

Üks täpsustus on siin oluline ja paljud töölehed eksivad selle vastu. Nähtav piir vastab plasmamembraani piirkonnale, kuid membraan ise, ligikaudu 7 kuni 10 nanomeetri paksune lipiidide kaksikkiht, on palju väiksem sellest, mida koolimikroskoop suudab eristada. Õpilased näevad raku optilist serva ja sinna kogunenud värvainet. Sama ettevaatus kehtib organellide kohta. Mitokondrid, endoplasmaatiline retiikulum, Golgi kompleks ja ribosoomid selles preparaadis nähtavale ei tule. Tavapärane valgusmikroskoop suudab heades tingimustes eristada detaile ligikaudu 0.2 mikromeetrini, nagu selgitab NCBI rakubioloogia taustamaterjal mikroskoopia tööriistadest, ning enamik ultrastruktuure jääb sellest piirist allapoole või selle lähedale. Suurem tühi suurendus muudab pildi suuremaks, lisamata detaile.

Miks värvub tuum kõige tumedamaks? Metüleensinine on katioonne värvaine, mis on lahuses positiivse laenguga ja seondub rakus negatiivse laenguga materjaliga, eelkõige nukleiinhapetega. Kromatiin koondab DNA tuuma, mistõttu koguneb sinna kõige rohkem värvainet. Tsütoplasma sisaldab RNA-d ja teisi laenguga molekule, seega värvub ka see, kuid hajusamalt ja heledamalt. Oluline täpsustus: metüleensinine ei ole DNA-spetsiifiline värvaine. Metüleensinise jaotumist tuumade kuvamisel käsitlev uurimus kirjeldab katiooni seondumist nukleiinhapperikaste piirkondadega ning varasemas kvantitatiivses uurimuses metüleensinise seondumisest rakupreparaatides leiti, et enamik seondunud värvainest oli seotud nukleiinhapetega. Tume tuum koos heleda tsütoplasmaga on seega kontrastimuster, mitte molekulaarne analüüs.

Õpilaste võimalikud vead ja nende tõlgendamine

Peaaegu iga ebaõnnestunud preparaat vastab ühele viiest mustrist. Õpeta õpilasi preparaadi probleemi tuvastama, mitte seda pimesi kordama.

Ülevärvimine muudab rakud ja tausta ühtlaselt tumedaks, nii et tuum kaob vaatevälja sisse. Paranda seda lühema värvimisaja või põhjalikuma loputamisega. Alavärvimine jätab alles kahvatud varjud, mis valguse suurendamisel kaovad; pikenda aega kolmekümne sekundi kaupa. Paksud äiged tekitavad tihedaid kattuvaid masse, kus ühtegi piirjoont ei saa jälgida; lahendus on mehaaniline: laota materjal järgmisel korral õhemalt, sest ükski loputus ei päästa rakukuhja. Õhumullid paistavad täiuslike ringidena teravate tumedate servadega ning eksitavad algajaid, kes peavad neid struktuurideks; aseta katteklaas uuesti aeglaselt nurga all. Rakkudel või nende ümber hajali paiknevad tillukesed tumedad täpid on tavaliselt suu tavapärased bakterid, nagu märgivad koolide tööjuhendid, näiteks Ingrid Science’i põserakkude tööjuhend. Need kinnitavad, et suus elab mikroorganisme, mis võib õpilastele hästi meelde jääda, kuid selles ülesandes ei saa neid liigini määrata ning neid ei tohiks joonistada raku osadena. Toidujäägid ja limaniidid värvuvad ebaühtlaselt ja tugevalt; eelnev loputus aitab neid vähendada.

Mida selle ülesandega teha ei saa

See on õppeotstarbeline vaatlus, mitte diagnostiline test. Rakkude välimuse põhjal ei saa klassiruumis tehtud värvinguga diagnoosida nakkust, vähki ega ühtegi haigust ning artiklit ei tohiks tõlgendada vastupidisele viitavana. Preparaat näitab kuju, piiri, tsütoplasmat ja tuuma kahel suurendusel. See ei näita membraani ultrastruktuuri, organellide detaile ega molekulaarset identiteeti. Piirangu selgesõnaline väljaütlemine kaitseb nii teaduslikku täpsust kui ka õpilasi: hea tulemus on õigesti tähistatud joonis koos ülesmärgitud suurenduse ja värvainega, mitte järeldus tervise kohta.

Õpilase tööleht ja tähistatud mikrofotod

Selle lehe kaks õppematerjali on ülal olev tähistatud mikrofoto ja all olev tööleht. Prindi igale õpilasele üks tööleht või kuva see ekraanile ja palu õpilastel kastid vihikusse kopeerida.

Kuidas seda 45 minuti pikkuses tunnis kasutada: kümme minutit ohutusjuhisteks ja proovivõtuks, kümme minutit värvimiseks ja preparaadi valmistamiseks, viisteist minutit vaatlemiseks ja joonistamiseks mõlemal suurendusel ning kümme minutit kontrollnimekirja täitmiseks ja tähistatud mikrofotoga võrdlemiseks. Kontrollnimekirja punktid on teadlikult lihtsad ja konkreetsed. Õhuke äige, õige värvimisaeg, tsütoplasmast tumedam tuum, ülesmärgitud suurendus. Õpilane, kes saab kõik neli punkti märgituks lugeda, on mõistnud põhimõtet, mille õpetamiseks see tund on mõeldud: mikroskoobid näitavad erinevusi ja värvingud tekitavad erinevused, mida tasub nähtavale tuua.