Metüleensinise mitokondriaalsete mõjude mõõtmine: hapnik, ATP ja membraanipotentsiaal

Oletame, et labor lisab metüleensinist mitokondritele, mille hingamine on häiritud, ja näeb hapnikutarbimise suurenemist. Loomulik oleks kirjutada, et värvaine taastas mitokondrite talitluse. See lause võib olla vale. Hapnikuvoog, ATP süntees ja membraanipotentsiaal on kolm eri mõistet. Neid seob sama organell samamoodi nagu varundamist, sünkroonimist ja jagamist seob sama pilvekaust: need on omavahel seotud, kuid alluvad eri reeglitele. Ühe segiajamine teisega viib vale tõlgenduseni isegi siis, kui kõik mõõtmised on tehniliselt õiged.

Metüleensinine muudab sellise segaduse tõenäoliseks, sest osaleb süsteemis, mida selle abil mõõdetakse. See läbib redokstsükleid, võttes elektrone vastu ahela varasemas osas ja loovutades neid hilisemas osas; see on lipofiilne katioon, mis koguneb pingestatud mitokondritesse; ning see on intensiivselt sinine ühend, mis neelab ja kiirgab valgust samades spektrivahemikes nagu levinud sondid. Üksainus mõõtenäit ei suuda kõike seda eristada. Budapesti mitokondriuuringutes näidatud usaldusväärne lähenemine on mõõta hapnikuvoogu koos ATP sünteesi kiiruse, membraanipotentsiaali ja vesinikperoksiidi vabanemisega ning kasutada igas etapis värvainespetsiifilisi kontrolle.

Respiromeetria mõõdab hapnikuvoogu, mitte energiatootmist

Kõrglahutusega respiromeetria, olgu selleks Oroboros Oxygraph või Seahorse'i rakuvälise voo analüsaator, näitab üht asja: kui kiiresti hapnikku redutseeritakse. See ei näita, mitu prootonit pumbati ühe elektroni kohta, kui suur osa gradiendist säilis ega kas ATP süntaas seda kasutas.

Terminoloogia on oluline. Isoleeritud mitokondrites annab substraat ilma ADP-ta lekkelise hingamise, substraat koos küllastava ADP kogusega oksüdatiivse fosforüülimise võimekuse ning lahtisidestaja tiitrimine maksimaalse elektronülekande võimekuse. Terviklikes rakkudes on Seahorse'i vastavad näitajad baashingamine, oligomütsiinitundlik ATP-ga seotud hingamine, prootonileke, FCCP-ga määratud maksimaalne hingamine ning rotenooni ja antimütsiini suhtes resistentne mitokondriväline hapnikutarbimine. Seahorse'i väljundite nimetamine olekuks 3 ja olekuks 4 omistab neile täpsuse, mida preparaat ei võimalda, nagu selgitab Agilenti Mito Stress Testi raamistik.

Metüleensinine lõhub intuitiivse seose suurema hapnikutarbimise ja suurema energiatootmise vahel. Isoleeritud merisea aju mitokondrites suurendas värvaine kontsentratsioonivahemikus 100 nM kuni 1 uM hapnikutarbimist puhkeolekus, kui substraatideks olid glutamaat koos malaadiga, suktsinaat ja alfa-glütserofosfaat; alfa-glütserofosfaadi korral oli suurenemine ligikaudu 64 protsenti. Samas jäi ADP-ga stimuleeritud hingamine tervetes mitokondrites sisuliselt muutumatuks, nagu näitas isoleeritud aju mitokondrite uuring. Kuna lekkeline hingamine suurenes, kuid ADP-ga stimuleeritud voog jäi samaks, väheneb arvutatud respiratoorse kontrolli suhe. See vähenemine ei tähenda, et värvaine kahjustas mitokondreid. See tähendab, et värvaine lisas tavapärasele hingamisele hapnikku tarbiva redokstsükli. Metüleensinise hapnikutarbimise mõõtmine, mis kirjeldab ainult suurenemist, on mõõtnud tegelikku keemilist protsessi, kuid pole öelnud midagi energia säilitamise kohta.

Taastamiskatsed näitavad sama lahknevust suuremas ulatuses. Kui kompleks I oli blokeeritud, taastus hapnikuvoog ligikaudu kolmekordselt, kuid ATP süntees suurenes vaid umbes 1.5 korda. Elektroodini jõudis rohkem hapnikku. Väiksem osa sellest panustas ATP tootmisse. Iga väide paranenud oksüdatiivse fosforüülimise kohta vajab ka ATP poolt arvestuses, eelistatavalt väljendatuna ATP ja hapniku suhtena koos nimetaja määratlemise põhimõttega.

ATP määramised mõõdavad sünteesikiirust, mida sisaldus ei asenda

ATP määramine vastab teisele küsimusele: kui palju ATP-d tekib ajaühikus. Kineetiline mõõtmine, kas minutite jooksul jälgitav jaanimardika lutsiferaasi luminestsents või heksokinaasi ja glükoos-6-fosfaatdehüdrogenaasi sidestatud analüüs lainepikkusel 340 nm, annab kiiruse. Üksainus ATP üldkoguse lõpp-punkti mõõtmine annab sisalduse, mis peegeldab sünteesi ja tarbimise vahet ning ütleb üksinda oksüdatiivse fosforüülimise kohta vähe.

Budapesti uurimisrühm kasutas sidestatud ensümaatilist meetodit, pärssides adenülaatkinaasi, ning leidis, et metüleensinine kontsentratsioonil 1 kuni 2 uM suurendas rotenooni ja antimütsiiniga töödeldud mitokondrites ATP tootmist mõõdukalt, kuid oluliselt. See on tegelik taastumine, kuid osaline. TEGDMA toksilisuse uuring jõudis teises mudelis sama tüüpi tulemuseni: 5 mM hambaravis kasutatavat monomeeri TEGDMA vähendas kompleksiga I seotud hingamist ligikaudu 286 vooühikult 28 vooühikule ning 2 uM värvainet taastas selle ligikaudu 86-ni.

Värvilise redoksühendi puhul on kaks kontrolli vältimatud. Esiteks kasuta oligomütsiini, et teha kindlaks, kui suur osa mõõdetud ATP sünteesist sõltub ATP süntaasist. Teiseks tee rakuvaba lisamiskatse saagise kontrollimiseks, kasutades teadaolevat ATP kogust, täielikku reagendisegu ja täpselt samu värvainekontsentratsioone nagu katses, vähemalt 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM ja 2 uM. Värvaine võib neelata kiiratud valgust, pärssida signaali tekitavat ensüümi või muuta reagendi redokskeemiat, ning üldised lutsiferaasianalüüsi juhised soovitavad just seda tüüpi häiringute jaoks biokeemilisi vastukontrolle. Ära eelda, et 1 uM korral artefakte ei esine, lihtsalt seetõttu, et kustutamine on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt tugevam.

Membraanipotentsiaali sondid mõõdavad värvaine jaotumist, mitte voogu

Safraniin O, TMRM ja TMRE, rodamiin 123 ning JC-1 on kõik membraani läbivad katioonid. Need kogunevad elektrokeemilise tasakaalu järgi negatiivselt laetud maatriksisse, mistõttu üldine fluorestsents näitab potentsiaali kaudselt sondi paiknemise kaudu. Ükski neist ei mõõda ATP-d ega elektronivoogu.

Igal sondil on eelistatud preparaadi tüüp. Safraniin O sobib isoleeritud mitokondritele ja permeabiliseeritud rakkudele, tavaliselt kontsentratsioonil ligikaudu 2 uM, ergastusega ligikaudu 495 nm ja emissiooniga ligikaudu 585 nm. Seda kasutatakse kustutusrežiimis, kus sondi sissevõtt muudab üldist fluorestsentsi. TMRM ja TMRE sobivad terviklikele rakkudele madala nanomolaarse laadimiskontsentratsiooniga mittekustutavas režiimis, kus depolarisatsioon vabastab värvaine ja mitokondrite fluorestsents väheneb; suure laadimiskontsentratsiooni korral võib signaali suund isekustutuse tõttu pöörduda. JC-1 annab mugava rohelise ja punase signaali suhte, kuid sõltub laadimisest ja mitokondrite massist, mistõttu sobib see kvantitatiivseks tööks halvemini kui hoolikalt kontrollitud TMRM. Need kompromissid on kokku võetud laialdaselt kasutatavas mitokondriaalse membraanipotentsiaali sondide ülevaates.

Metüleensinine tekitab optilisi häiringuid just kasutatavates töökontsentratsioonides. Selle neeldumisribad vahemikus ligikaudu 600 kuni 665 nm kattuvad punaste sondide emissiooniga, mistõttu sisefiltriefektid, kustutamine ja ergastusvalguse neeldumine on kõik võimalikud. Värvaine on ka teine lipofiilne katioon, mille enda jaotumine muutub koos mõõdetava potentsiaaliga. Kaitseks tuleb kasutada mitut sõltumatut mõõtmist ja tühikatseid: ainult sond, ainult värvaine, sond koos iga värvainekontsentratsiooniga, täielik depolarisatsioon FCCP-ga nulltaseme määramiseks ning ideaaljuhul teine, optiliselt erinev sond. Kompleksist III möödumise uuring lõi selleks eeskuju, korrates membraanipotentsiaali taastamise mõõtmist pärast antimütsiini ja müksotiasooliga inhibeerimist nii safraniin O kui ka TMRM-iga ning saades kvalitatiivselt sama taastumise. Üks optiline indikaator annab vihje. Kaks sõltumatut indikaatorit annavad tõendi.

Kolm preparaati, kolm erinevat küsimust

Isoleeritud mitokondrid, permeabiliseeritud rakud ja terviklikud rakud ei ole ühe analüüsi omavahel vahetatavad tundlikkusseadistused. Need on eri lähenemised erinevate toimimispõhimõtetega.

Isoleeritud mitokondrid säilitavad elektrontranspordiahela, sisemembraani ja maatriksi talitlusaparaadi, kuid eemaldavad plasmamembraani, tsütosooli ja võrgustiku ülesehituse. Just see eemaldamine ongi eesmärk: substraadid, ADP, inhibiitorid ja värvainekontsentratsioonid on täpselt määratud, mistõttu saab tuvastada konkreetse raja. Selle hind on loomuliku substraadivarustuse, signaaliülekande ja energiavajaduse kadumine.

Permeabiliseeritud rakud säilitavad mitokondrid suures osas nende rakulises keskkonnas, lastes samal ajal väljast lisatud substraadid ja ADP läbi avatud plasmamembraani. Need on õige vahend substraadi oksüdatsiooniraja defekti tuvastamiseks rakulises kontekstis. Liigne permeabiliseerimine kahjustab välismembraani ning tsütosoolne regulatsioon kaob väljapesemise tõttu.

Terviklikud rakud säilitavad kõik: plasmamembraani barjääri, tsütosoolsed redutseerijad, endogeense substraaditranspordi, mitokondrite võrgustiku ja ATP vajaduse. Need on füsioloogiale kõige lähemal ja mehhanismi eristamisest kõige kaugemal, sest värvaine sissevõtt, redutseerimine ja eraldatud kogunemine kujundavad kõik mitokondriteni tegelikult jõudva värvaine hulka.

TEGDMA uuring kasutas teadlikult kõiki kolme tasandit: isoleeritud aju mitokondreid oksüdatsiooni ja potentsiaali taastamise uurimiseks värvaine abil, permeabiliseeritud hambapulbi tüvirakke peamiselt häire lokaliseerimiseks kompleksiga I seotud substraatide oksüdatsioonile ning terviklikke tüvirakke 2 uM värvaine füsioloogilise kogumõju uurimiseks pärsitud hapnikutarbimisele. Lugejatele, kes võrdlevad mitokondriaalseid mõõtenäitajaid eri preparaatides, annab raja kohta taustteavet kaasartikkel sellest, kuidas metüleensinine liigutab elektrone läbi hingamisahela, ning metüleensinise hingamisuuringute lugemise juhend käsitleb kontsentratsioonide ja inhibiitorite kasutamise loogikat.

Kontrollid, mida redoksaktiivne värvaine nõuab

Redokstsükleid läbiv ühend vajab pikemat kontrollide loetelu kui tavaline inhibiitor, sest üksnes värvainega seotud keemia võib jäljendada bioloogilisi protsesse.

Respiromeetrias kasuta triivi kontrollimiseks ainult puhvrit sisaldavat kambrit, puhvri ja värvainega kambrit ilma bioloogilise materjalita, värvainet koos kõigi analüüsis esinevate rakuväliste redutseerijatega ning mõõtmise lõpus rotenooni ja antimütsiini, et määrata terviklikes rakkudes mitokondriväline hapnikutarbimine. Arvesta, et redutseeritud värvaine taasoksüdeerub, kandes elektrone üle hapnikule ja moodustades vesinikperoksiidi. Seetõttu alahindab ainult värvainega tühikatse ilma elektronidoonorita rakuvaba hapnikutarbimist, mis tekib siis, kui saadaval on NADH või NADPH.

Vesinikperoksiidi mõõtmiseks eelista kalibreeritud Amplex UltraRedi koos mädarõika peroksüdaasiga mitteselektiivsetele DCFDA värvainetele, kontrolli tulemust katalaasiga ja testi sõltuvust valgustusest, sest värvaine on fotosensibilisaator. Aju mitokondrite uuringus leiti, et peroksiidikoormus suurenes juba 100 nM värvaine korral rohkem kui neljakordselt, samal ajal kui selle eemaldamine aeglustus; peroksiid tekkis otse redutseeritud värvainest ilma superoksiidse vaheühendita. Sondi valiku ja valguskontrollide üksikasju käsitleb kaasartikkel reaktiivsete hapnikuühendite mõõtmisest värvainekatsetes, ning laiemat küsimust, millal peroksiid toimib signaalina ja millal koormusena, käsitletakse koos raku redokstasakaalu ja antioksüdantidega seotud väidetega.

Raja kohta tehtavate väidete kontrollimiseks testi kompleksi III mõlemat inhibiitori seondumiskohta: antimütsiin A Qi-kohas ja müksotiasool Qo-kohas, lisaks kompleksi IV lõpp-punkt tsüaniidiga. Varasem hiire aju uuring kirjeldas rotenooniga blokeeritud, kuid mitte antimütsiiniga blokeeritud hingamise taastumist värvaine toimel, samas kui hilisem kolme liigi uuring leidis osalise taastumise mõlema inhibiitori korral ja tõendeid tsütokroom c otsese redutseerimise kohta. Käsitle möödumisrada uuemate andmetega kooskõlas oleva võimalusena, mitte lõplikult tõestatuna, sest värvainekontsentratsioon, inhibiitori seondumiskoht, substraaditingimused ja värvaine jaotumine muudavad kõik vaadeldavat rada.

Mõõtmismeetodi valiku maatriks

Kasuta seda tabelit, et valida mõõtmine küsimuse järgi, mitte vastupidi.

Minimaalne veenev väide eeldab samade värvainekontsentratsioonide, 100 nM, 300 nM, 1 uM ja 2 uM, kasutamist hapnikuvoo mõõtmisel lekkelise hingamise, ADP, oligomütsiini ja lahtisidestaja tingimustes, ATP sünteesi kiiruse mõõtmisel, membraanipotentsiaali mõõtmisel eelistatavalt kahe sondiga ning kalibreeritud peroksiidi vabanemise mõõtmisel koos katalaasi- ja rakuvabade kontrollidega. Esita seotud näitajate kogum: hapnikuvoog koos ATP sünteesi kiiruse, ATP ja hapniku suhte, potentsiaali ning peroksiidiga. Igaüks neist arvudest eraldi on mõõtmistulemus, mis alles otsib tähendust.