Metüleensinisega lihtvärvimine ja Grami järgi värvimine: mida kumbki meetod tõendada saab

Üliõpilane valmistab äigepreparaadi kultuurist, mille märgistus on E. coli, katab selle üheks minutiks metüleensinisega, loputab ja vaatleb immersioonobjektiiviga. Vaatevälja katavad sinised pulgad. Laboriaruandes seisab: „Gramnegatiivsed pulkbakterid identifitseeritud kui E. coli.” Vaatlus on õige. Selle preparaadi põhjal ei ole aga selline järeldus põhjendatud.

Viga on mõisteline, mitte tehniline. Üliõpilane käsitles lihtvärvimist nii, nagu see oleks diferentsiaalne test. Lihtvärvimine ja Grami järgi värvimine vastavad erinevatele küsimustele, sest need põhinevad erinevatel värvimispõhimõtetel. Üks küsib: milline kuju on nähtav? Teine küsib: kuidas käitub rakukest katse tingimustes? Kui need kaks segi ajada, sünnib õigesti värvitud preparaadist põhjendamatu aruanne.

See võrdlus hoiab kaks meetodit lahus, näitab, milliseid väiteid kummagi tulemus võimaldab esitada, ning vastab kahele küsimusele, mida üliõpilased kõige sagedamini küsivad: kas metüleensinist saab kasutada Grami järgi värvimisel ja mida E. coli värvimine metüleensinisega tegelikult näitab.

Lühivastus

Metüleensinisega lihtvärvimine muudab kõik värvuvad rakud ühtemoodi siniseks, mistõttu see näitab morfoloogiat (pulgad, kerad, spiraalid) ja asetust (üksikult, paaridena, ahelatena), kuid ei ütle midagi Grami rühma kohta. Grami järgi värvimine lisab joodi, värvitustamise etapi ja järelvärvi, eristades nii bakterid grampositiivseteks (lillad) ja gramnegatiivseteks (roosad või punased) selle alusel, kuidas nende rakuümbrised värvainet säilitavad. Sinised pulgad pärast metüleensinisega värvimist tähendavad: „Proovis on pulgakujulised rakud.” Roosad pulgad pärast täielikku Grami värvimisprotseduuri tähendavad: „Proovis on gramnegatiivsed pulkbakterid.” Teine väide on tugevam, sest protseduur hõlmas lisatesti.

Ülevaate ühe värvainega bakterite värvimise meetoditest, mille hulka selle artikli meetod kuulub, leiad mikroskoopilise värvimise atlasest.

Lihtvärvimine: üks värvaine, üks küsimus

Metüleensinine on aluseline (katioonne) värvaine. Selle värviline ioon kannab positiivset laengut ja seondub raku negatiivselt laetud struktuuridega, sealhulgas nukleiinhapete ja happeliste pinnarühmadega, nii et rakud paistavad heledal taustal sinistena. OpenStax kirjeldab seda positiivvärvimise põhimõtet oma värvimist käsitlevas peatükis. Värvaine katioon ise on väike tasapinnaline fenotiasiiniioon, mida kirjeldatakse üksikasjalikult metüleensinise keemia ülevaates; kloriidne vastasioon värvust ei anna.

Tavapärane õppeprotokoll on teadlikult lihtne: valmista õhuke äigepreparaat, lase õhu käes kuivada, fikseeri kuumusega, kata umbes 1% metüleensinise vesilahusega ligikaudu üheks minutiks, loputa õrnalt veega, tupsuta kuivaks ja vaatle õliimmersiooniga. LibreTextsi õppeprotokoll kirjeldab täpselt seda 1% lahuse ja üheminutilise värvimise varianti, märkides samas, et mõned laborid pikendavad värvimisaega. Ei mingit peitsi, värvitustajat ega teist värvainet. Just nende puudumine ongi oluline. Kui kasutatakse ainult üht värvainet ja seda valikuliselt ei eemaldata, jäävad kõik värvainet siduvad rakud sama värvi.

E. coli puhul on oodatav vaatepilt sinised pulgad (batsillid), mis paiknevad üksikult, paaridena või väikeste rühmadena. Sinine värvus tuleb värvainest. Pulgakujulisus tuleneb organismist. Nende kahe tunnuse kombinatsioon ei identifitseeri aga organismi, sest paljud liigid on pulgakujulised ja paljud pulkbakterid värvuvad lihtvärvimisel siniseks. ATCC toob oma mikrobioloogiliste kultuuride juhendis selgelt välja selle piirdumise morfoloogiaga. Õige aruanne ütleb: „Täheldati siniseid batsille.” Kõik, mis läheb kujust ja asetusest kaugemale, vajab lisatõendeid.

Grami järgi värvimine: neli reagenti, üks käitumist hindav test

Grami järgi värvimine on diferentsiaalne värvimismeetod. Kõik rakud läbivad sama etappide jada ning vaadeldakse, millised rakud säilitavad esimese värvaine ja millised selle kaotavad. Ameerika Mikrobioloogia Seltsi Grami värvimisprotokollid määratlevad tavapärase neljaetapilise järjekorra: kristallviolett (esmane värvaine), Grami joodilahus (peits), alkohol või atsetooni ja alkoholi segu (värvitustaja) ning seejärel safraniin (järelvärv).

Tavapärane õppemudel selgitab eristumist rakuümbrise ehituse kaudu. Grampositiivsetel rakkudel on paks peptidoglükaanist rakukest, mis kaotab alkoholiga pesemisel vett ja säilitab kristallvioleti-joodi kompleksi. Gramnegatiivsetel rakkudel on õhuke peptidoglükaanikiht ning lipiidirikas välismembraan, mida värvitustaja lõhub, mistõttu kompleks pestakse välja ja rakud võtavad seejärel sisse safraniini. NCBI Bookshelfi Grami värvimise ülevaade esitab selle rakukestal põhineva selgituse. Spetsialistid lisavad, et kogu füüsikalis-keemiline mehhanism on keerulisem kui pelgalt rakukesta paksus, kuid laboritulemuse tõlgendamisel kehtib käitumisreegel: lilla tähendab, et värvaine säilis; roosa tähendab, et see kadus ja rakk värvus seejärel järelvärviga.

Illustreerivad paneelid. Stiliseeritud joonised meetodite võrdlemiseks, mitte kaameraga tehtud mikrofotod. Värve on põhimõtte õpetamiseks lihtsustatud: lihtvärvimisel üks värvus, pärast Grami värvitustamist kaks värvust.

Kas metüleensinist saab kasutada Grami järgi värvimisel

Seda küsimust saab mõista kahel viisil ning need vajavad erinevaid vastuseid.

Esimene tõlgendus: kas ühekordne metüleensinisega katmine saab asendada kogu Grami värvimisprotseduuri? Ei. Ilma joodi, värvitustaja ja järelvärvita puudub eristav etapp, seega Grami rühma ei testita. Ainult metüleensinise kasutamise järel saadud sinine vaateväli on lihtvärvimise tulemus, isegi kui pudel seisab Grami värvimisreagentide kõrval. Ära märgi seda Grami värvimise tulemusena.

Teine tõlgendus: kas metüleensinine saab 4. etapis asendada safraniini järelvärvina? Oma toimelt saab see värvitustatud rakke värvida ning õpikuülesandes eeldatakse sellise asenduse järel lillasid grampositiivseid ja siniseid gramnegatiivseid rakke. Loogika on õige, sest korrektselt värvitustatud gramnegatiivsed rakud on peaaegu värvitud ja võtavad sisse teise katioonse värvaine. Kuid see ei ole standardprotokoll. ASM-i protokollid näevad ette safraniini, mõnes variandis ka tunnustatud alternatiive, näiteks aluselist fuksiini, kuid mitte metüleensinist. Sellel on ka praktiline puudus: sinist on lillast raskem eristada kui roosat lillast, eriti algajatel ja nõrgaks jäänud mikroskoobilampide valguses. Õppetöös ja iga olulise tulemuse puhul kasuta protokollis nimetatud järelvärvi, tavaliselt safraniini, ning käsitle metüleensinisega järelvärvimist demonstratsioonivariandi, mitte samaväärse standardmeetodina.

Seotud küsimust, kuidas metüleensinine erineb teistest ühe värvainega meetoditest, käsitletakse bakterite lihtvärvimismeetodite võrdluses.

Mida E. coli värvimine metüleensinisega tõendab ja mida mitte

E. coli on gramnegatiivne pulkbakter, kuid see lause ühendab mitme meetodiga saadud fakte: morfoloogia pärineb mikroskoopiast, Grami reaktsioon Grami järgi värvimisest ning identiteet kultiveerimisest koos biokeemiliste või molekulaarsete testidega. Metüleensinisega värvitud äigepreparaat annab ainult esimese osa. See näitab, et värvitud proovis on pulgakujulised rakud, ja kuidas need paiknevad. See ei määra Grami reaktsiooni, sest värvitustamise katset ei tehtud. See ei identifitseeri liiki, sest paljude liikide pulgakujulised rakud näevad selle lahutusvõime juures sarnased välja.

Just siin tekib aruannetes etteaimatav viga. Kirjutaja toob taustteadmise („see kultuur peaks olema E. coli ja E. coli on gramnegatiivne”) vaatlust kirjeldavale reale, mistõttu näib, et preparaat kinnitab seda, mida tegelikult üksnes eeldati. Selgem aruanne hoiab need tasandid lahus: „Metüleensinisega lihtvärvimine: täheldati siniseid batsille; ainult morfoloogia, Grami rühma ei testitud.” Seejärel, kui Grami järgi värvimine tehti korrektselt koos kontrollidega: „Grami järgi värvimine: roosad pulgad, mis on kooskõlas gramnegatiivse tulemusega.” Liigi identiteet selgub hiljem identifitseerimise töövoost, mitte pelgalt värvusest.

Praktiline tõlgendamisjuhend

Kasuta laboris seda otsustusreeglit. Kui kõik rakud on ühte värvi ja protokollis kasutati üht värvainet ilma värvitustajata, tegid lihtvärvimise. Kirjelda kuju, hinnangulist suurust ja asetust. Sellega piirdu. Kui protokoll hõlmas kristallvioletti, joodi, värvitustajat ja järelvärvi koos teadaolevate positiivsete ning negatiivsete kontrollidega, tegid Grami järgi värvimise. Kirjelda värvust koos morfoloogiaga: lillad kokid ahelatena, roosad pulgad jne.

Suurema osa segadusest põhjustavad kolm viga. Esiteks siniste pulkade ületõlgendamine E. coli kinnitusena. Teiseks metüleensinisega värvitud preparaadi märkimine laboripäevikusse pealkirja „Grami järgi värvimine” alla, mida hilisemad lugejad valesti tõlgendavad. Kolmandaks järelvärvide kergekäeline vahetamine ja seejärel eri laborite värvuste võrdlemine nii, nagu värvipaletid oleksid samad. Kõigil neil vigadel on sama lahendus: nimeta meetod, mida tegelikult kasutati, ja väida ainult seda, mida see meetod testib.

Lihtvärvimine on omal kohal just seetõttu, et lubab väita vähe. See on kiire, talub väikseid teostusvigu ja on piisav, kui küsimus puudutab morfoloogiat: kas midagi on olemas ja millise kujuga see on? Kui küsimus puudutab liigitamist, tee diferentsiaalne test. Sinine preparaat näitab, millised rakud välja näevad. Lilla või roosa preparaat näitab, kuidas nende rakukestad käituvad. Kumbki preparaat üksi ei määra liiki.