Metüleensinise antimikroobsed ja seenevastased uuringud: valgus ja pimedus

Kaks lugejat näevad väljendit „metüleensinise antimikroobne toime” ja kujutlevad eri asju. Üks kujutleb sinist vedelikku, mis mürgitab mikroobe kokkupuutel. Teine kujutleb protseduuri, kus värvaine koos punase valgusega neid hävitab. Mõlemas ettekujutuses on oma tõetera. Kumbki ei anna tervikpilti ning just nende segiajamisel lähevad enamik veebis esitatud väiteid eksiteele.

See eristus ongi käesoleva ülevaate teema. Piisava kontsentratsiooni korral on metüleensinisel pimedas mõõdukas toksilisus. Punase valguse toimel muutub see fotosensibilisaatoriks: neelab footoni, jõuab reaktiivsesse triplettseisundisse ja käivitab oksüdatiivsed keemilised reaktsioonid, mis kahjustavad korraga paljusid sihtmärke. Sellel valgusega aktiveeritud toimel on oma nimi, antimikroobne fotodünaamiline ravi, ja oma tingimused. Kontsentratsioon üksi seda ei määratle. Tulemuse määravad lainepikkus, valgusdoos, inkubatsioon, hapnik ja organism.

Kaks hävitamismehhanismi

Vaatleme kõigepealt toimet pimedas. Metüleensinine on positiivse laenguga fenotiasiiniumvärvaine. See seostub mikroobide ümbristega, siseneb eri määral rakkudesse ning osaleb redoks- ja seondumisreaktsioonides. Footoneid selles ei osale. Mikroobid hukkuvad, kuid ainult kontsentratsioonidel, mis erinevad organismiti suuresti, ning mehhanism ei piirdu ühe selgelt määratletud sihtmärgiga.

Fotodünaamiline mehhanism lisab valguse. Punased footonid lainepikkusega ligikaudu 630 kuni 680 nm kattuvad värvaine neeldumisribaga, mille monomeeri neeldumismaksimum on umbes 664 nm juures. Neeldumine viib värvaine lühiealisse singletseisundisse ja seejärel pikemaealisse triplettseisundisse. Sealt edasi kulgevad kahte tüüpi reaktsioonid. I tüüpi reaktsioonides annab triplettseisundis molekul elektroni substraadile ja käivitab radikaalreaktsioonid, milles osalevad superoksiid ja hüdroksüülradikaalid. II tüüpi reaktsioonides annab see energia otse põhiseisundis hapnikule ja tekitab singletset hapnikku. Mõlemad võivad toimuda korraga ning värvaine nimetamine üksnes singletse hapniku tekitajaks on liigne lihtsustus. Fenotiasiiniumfotosensibilisaatorite struktuuri ja aktiivsuse seose ülevaade näitab seda otseselt: sarnaste värvainete bakteriaalne fototoksilisus ei sõltunud ainult singletse hapniku saagisest, sest rakku pääsemine, paiknemine ja redutseerumine mitteaktiivseks leukovormiks olid sama tähtsad kui fotofüüsika. Lainepikkuse valiku aluseks olevat fotokeemiat selgitab kaasülevaade värvaine ja punase valguse koosmõjust.

Singletne hapnik on ühe kasuliku omaduse keskmes. See reageerib korraga paljude biomolekulidega, mistõttu rünnak on mitmeteguriline ega ole suunatud ühele ensüümile või seonduvale valgule. Fotodünaamilise antimikroobse kemoteraapia aluskäsitlus tõi selle põhjuseks, miks tavapärased resistentsusprofiilid on vähese tähtsusega: täiendav penitsilliini siduv valk või muteerunud topoisomeraas ei tõkesta reaktiivse hapniku järsku teket. See loogika pidas paika metitsilliiniresistentse Staphylococcus aureus’e ja vankomütsiiniresistentsete enterokokkidega tehtud katsetes, nagu näitab allolev tabel. See ei tähenda, et resistentsus oleks võimatu, vaid et see toimib teisiti. Eflukspumbad ja antioksüdatiivsed kaitsemehhanismid võivad siiski muuta vajalikku doosi, eriti seente puhul.

Organismide ja uuringumudelite koondtabel

See tabel on artikli keskne osa. Iga väärtus sõltub protokollist: sama värvaine, kuid erinev valgusdoos või inkubatsioon annab teise arvu. MBC, MLC ja MIC ei ole samatähenduslikud. MBC ja MLC tähendavad siin, et ümberkülvil ei tuvastata ellujäänuid, MIC aga kasvu pärssimist. Valgustingimused on esitatud iga kirje juures.

Organism ja mudel	Tulemus pimedas	Tulemus valgusega	Tingimused
S. aureus NCTC 6571, planktoniline suspensioon	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Ülevaate tabel, valge valgus 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, planktoniline suspensioon	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	1997. aasta algne protokoll, 1.7 mW per cm2 1 tunni jooksul, ligikaudu 6.3 J per cm2, inokulum umbes 10^6 CFU per mL, esitatud algses fenotiasiiniumühendite fotobakteritsiidse toime uuringus
MRSA EMRSA-15, planktoniline	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Ülevaate tabel, ligikaudu 12 J per cm2, neljakordne tundlikkuse suurenemine
MRSA EMRSA-16, planktoniline	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Sama protokoll mis eespool
E. coli NCTC 9001, planktoniline	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Sama protokoll, viiekordne tundlikkuse suurenemine
P. aeruginosa NCTC 10622, planktoniline	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Sama protokoll, kahekümnekordne tundlikkuse suurenemine
E. faecalis NCTC 775, planktoniline	MLC 100 uM	MLC 100 uM	1997. aasta protokoll doosiga 6.3 J per cm2, selle tüve ja doosi puhul paranemist ei olnud
Vankomütsiiniresistentne E. faecium, planktoniline	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Ülevaate tabel, lähtevärvainega paranemist ei olnud, hüdrofoobsemate metüülitud derivaatidega aga oli, vastavalt vankomütsiiniresistentse enterokoki uuringule
Candida albicans, planktoniline	MIC üle 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39 ja 1.59 ug per mL doosidel 5, 10 ja 15 J per cm2	30-minutiline eelinkubatsioon pimedas, punane LED 600 kuni 650 nm maksimumiga 635 nm, vastavalt metüleensinise seenevastase fotodünaamilise toime doosi-vastuse uuringule
C. albicans YEM14 võrreldes eflukspumpade üleekspressiooniga tüvega, hävitamine CFU põhjal	Ei kohaldu	Lähtetüvel ligikaudu 5 log vähenemine, CDR1/CDR2 üleekspressiooniga tüvel peaaegu puuduv hävitamine	100 uM värvainet, 30-minutiline inkubatsioon, 660 nm doosiga 60 J per cm2, vastavalt eflukspumpade mõju uuringule metüleensinise valgusvahendatud hävitamisel
Trichophyton rubrum’i hüüfid võrreldes eostega	Ei kohaldu	Hüüfide MIC ligikaudu 6.3 ug per mL, eostel ligikaudu 2.0 ug per mL; kolooniate tekke täielikuks tõkestamiseks oli hüüfidel vaja 5 ug per mL koos doosiga 100 J per cm2, eostel aga 1.25 ug per mL koos doosiga 40 J per cm2	635 nm fotodünaamiline protokoll, vastavalt dermatofüütide arengujärkude tundlikkuse uuringule
33 liigist koosnev küps igemealune biokile, Calgary seade, 6. päev	Ainult MB vähendas koguarvu üle 80 protsendi	MB koos 660 nm LED-valgusega vähendas metaboolset aktiivsust ligikaudu 55 protsenti, koosluse ulatuslikku ümberkujunemist ei toimunud	0.01 protsenti värvainet (100 ug per mL), 660 nm ligikaudu 330 mW per cm2 juures 5 minuti jooksul, anaeroobne kasv, vastavalt mitmeliigilise suuõõne biokile in vitro uuringule

Silma paistab kolm mustrit. Esiteks hukkuvad grampositiivsed stafülokokid väikestel mikromolaarsetel kontsentratsioonidel, samas kui gramnegatiivsed pulkbakterid vajavad pimedas ligikaudu sada korda rohkem värvainet, sest gramnegatiivsete bakterite välismembraan piirab selle sisenemist. Valgus vähendab erinevust, kuid ei kaota seda. Teiseks on metüleensinise seenevastane toime olemas, kuid sõltub tingimustest: Candida hävitamine metüleensinisega paraneb järsult valgusdoosi suurenedes ning üksainus fenotüübiline muutus, näiteks eflukspumba üleekspressioon, võib sama doosi juures kaotada 5 log vähenemise. Kolmandaks käitub küps biokile suspensioonidest erinevalt, nagu näitab suuõõne biokile tabelirida.

Bakterid: kus valgus aitab kõige rohkem ja kus mitte

Stafülokokid on tundlik näide. Isegi epideemilise MRSA kohta ülevaate tabelis toodud väärtused on valguse rakendamisel võrdluseks kasutatud vankomütsiini väärtustega võrdsed või neist väiksemad. Dimetüülitud derivaadid toimisid veelgi paremini, sest metüülimine suurendas lipofiilsust ja singletse hapniku saagist ning vähendas redutseerumist leukovormiks. See keemiline üksikasi on oluline: see näitab, et hävitamine sõltub nii kohalejõudmisest kui ka fotofüüsikast, mitte ainult fotofüüsikast.

Gramnegatiivsed organismid ilmestavad kohalejõudmise tähtsust. Pseudomonas vajas pimedas 500 uM ja valgusega 25 uM, mis tähendab kahekümnekordset paranemist, kuid valgusega saadud väärtus on siiski märksa suurem kui stafülokokkidel. Katioonne laeng aitab värvainel välismembraanile läheneda, kuid läbipääs jääb piiravaks teguriks. Koostis, inkubatsiooniaeg ja derivaadi valik muudavad neid arve rohkem kui sama värvaine korduv kasutamine suurema doosiga.

Enterokokid annavad põhjust ettevaatuseks. Vanemate protokollide korral ei näidanud E. faecalis valgusest mingit kasu ning vankomütsiiniresistentne E. faecium vajas rohkem valguse asemel teistsugust molekuli. Igaüks, kes esitab ühe metüleensinise MBC väärtuse üldise antibakteriaalse konstandina, tõlgendab kirjandust valesti. Sellist konstanti ei ole. On ainult väärtused, mis sõltuvad tüvest, söötmest, inokulumist, inkubatsioonist, lainepikkusest ja kiirgusdoosist. Neid väärtusi enesepettuseta lugema õpetab hävitamiskõverate tõlgendamise juhend.

Seened: tundlikud, kuid määravad arengujärk ja pumbad

Glükaanidest, mannaanidest ja kitiinist koosnevad seente rakukestad tekitavad bakteritest erineva rakku pääsemise probleemi ning seentel on lisaks aktiivsed kaitsemehhanismid. Eespool kirjeldatud Candida efluksi tulemus on kõige selgem näide: sama värvaine, sama valgus ja sama sööde, kuid üleekspressiooniga tüvi jäi ellu, samal ajal kui lähtetüvi kaotas ligikaudu 99.999 protsenti kolooniaid moodustavatest ühikutest. Dermatofüütide puhul lisandub arengujärgu mõju. Eosed hukkuvad palju kergemini kui hüüfid, nii et eosed kõrvaldav protokoll võib sama doosi juures jätta hüüfifragmendid eluvõimeliseks.

Seepärast vajavad metüleensinise seenevastase toime uuringud sama täpset valgustingimuste kontrolli kui bakteriuuringud. Küünte ja naha kliinilistes fotodünaamilistes uuringutes ühendati 1 kuni 2 protsenti värvainet mõõdetud punase valgusega määratletud kiirgusdoosidel ning järelkontrolliga, eristades kliinilist väljanägemist mükoloogiliselt kinnitatud seene kõrvaldamisest. Neid uuringuid käsitleb küünte ja naha seeninfektsioonide fotodünaamilise ravi tõendite kokkuvõte. Lahjendatud värvaine tupsutamine kahjustuskohale toavalguses annab küll sama värvi, kuid jätab protseduuri tegemata.

Biokile kontroll: 33 liigiga suuõõnemudel

2024. aasta mitmeliigilise suuõõne biokile uuring väärib tähelepanu, sest selles katsetatakse keerulist, mitte lihtsat juhtumit. Kolmkümmend kolm suuõõne liiki, sealhulgas Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium ja suuõõne streptokokid, kasvasid anaeroobselt 6. päevaks küpseks biokileks. Töötlemisel kasutati 0.01 protsenti värvainet ja 660 nm LED-valgust 5 minuti jooksul suure kiiritustiheduse juures. Nii värvaine üksi kui ka valgus üksi vähendasid koguarvu märkimisväärselt ning nende kombinatsioon vähendas metaboolset aktiivsust ligikaudu poole võrra, kuid kooslus ei kujunenud ümber ja biokile ei steriliseerunud.

See on tegelik toime, millel on selgelt tunnistatud piir. See toetab fotodünaamilise ravi kasutamist kohaliku lisameetmena puhastatud igemetaskus, mitte loputusvahendina, mis ravib diagnoositud parodontiiti üksinda. See toob meid üldise ülekantavuse probleemi juurde.

Miks laboris hävitamine ei võrdu raviga

Planktonilise MBC katses puutuvad ühesugused rakud hapnikurikkas söötmes kokku ühtlaselt jaotunud värvaine ja valgusega. Kahjustuskolle ei paku neist tingimustest ühtegi. Maatriks aeglustab sisenemist, persisterrakkude sarnased seisundid taluvad oksüdatsiooni, veri ja eksudaat neelavad valgust, koe geomeetria jätab varjualasid ning hapnikuvaesed piirkonnad nõrgendavad II tüüpi reaktsioone, sest singletne hapnik eeldab juba määratluse järgi molekulaarse hapniku olemasolu. Segainfektsioonides lisanduvad liigid, mis erinevad rakku pääsemise ja tundlikkuse poolest, mistõttu ühe referentstüve väärtus ei saa kogu kollet esindada.

Suuõõne näide teeb selle lõhe konkreetseks. Porphyromonas’e või streptokokkide vähendamine katseplaadil või kasvatatud biokile aktiivsuse vähendamine poole võrra ei tõenda, et sinine loputuslahus ravib parodontiiti, kõrvaldab endodontilise infektsiooni või likvideerib baktereemia. Kliiniline parodondiravi põhineb biokile mehaanilisel lõhkumisel ja eemaldamisel ning igemetasku anatoomia arvestamisel; valguspõhist ravi uuritakse kohaliku lisameetmena. Värvaine kontsentratsioonil, mis hävitab baktereid katseplaadi süvendis, ei ole kindlat seost kontsentratsiooniga, mis jõuab bakteriteni igemepiiri all, ning toavalgus ei ole 660 nm valgusdoos. Igasuguse suukaudse kasutamise annustamise, ohutuse ja koostoimete piirid tuleb määrata koos arstiga, nagu on selgitatud ohutuse ja koostoimete käsitluses.

Mida need tõendid ei tähenda

Need ei tõenda sobivust koduseks desinfektsioonivahendiks. Bakteritsiidse toime tabelites kasutatakse kindlaksmääratud tüvesid, söötmeid, kokkupuuteaegu, spektreid ja kiirgusdoose. Need ei ütle midagi köögipindade, orgaanilise mustuse korral vajalike kokkupuuteaegade ega desinfektsiooni regulatiivsete standardite kohta.

Samuti ei ole see süsteemse antibiootikumi asendus. Tavapärane fotodünaamiline toime vajab värvainet, neeldunud valgust ja hapnikku samas kohas samal ajal. Valgus ei jõua sügavatesse või laialt levinud kolletesse nii, nagu allaneelatud ravim jõuab verre. Kirjanduses käsitletakse seda lähenemist ligipääsetava kohaliku infektsiooni korral või lisameetmena, täpselt nii, nagu Wainwright kohaliku desinfektsiooni algusest peale määratles.

Tasakaalukas kokkuvõte on kitsam, kuid siiski huvitav. Metüleensinisel on pimedas mõõdukas antimikroobne aktiivsus ning punane valgus võimaldab paljude bakterite ja seente puhul märksa suuremat fotodünaamilist toimet. Valguse ja pimeduse tulemuste erinevused võivad olla suured, näiteks Pseudomonas’e puhul 500 kuni 25 uM ja epideemilise MRSA puhul 80 kuni 20 uM, kuid nende kõrval leidub õpetlikke ebaõnnestumisi enterokokkide ja tõhusa efluksiga Candida puhul. Ülekantavust määravad värvaine nominaalse kontsentratsiooni kõrval sama palju selle kohalejõudmine, biokile füsioloogia ja hapnik. Hoidke need tingimused nähtaval ning arvudel on tähendus. Jätke need kõrvale ja arvud ei tähenda midagi.