Metüleensinine, Nrf2 ja mitokondriaalne biogenees: mida mõõdeti ja mis on endiselt oletus

Metüleensinisest kirjutades kordub sageli üks lause: see aktiveerib Nrf2 ja tekitab uusi mitokondreid. Lause mõjub ühe väitena, kuid sisaldab kaht eri mõistet, mida on uuritud eri süsteemides ja eri tüüpi tõendite abil. Esimene on signaalirada, sensor, mis lülitab sisse kaitsegeenid. Teine on ehitusprogramm: rakk toodab juurde mitokondriaalset masinavärki. Signaal võib ehituse käivitada, kuid signaali vallandumise näitamine ei ole sama mis valminud hoone näitamine ning suurem ehitusmaterjali kogus ei tõenda paremat energiavarustust. Selles artiklis hoitakse need kolm asja lahus.

Nrf2 mõiste: sensor, mitte kaitsekilp

Nrf2 (erütroidse tuumafaktoriga 2 seotud faktor 2) on transkriptsioonifaktor ehk valk, mille ülesanne on geene sisse lülitada. Puhkeolekus hoiab seda tsütoplasmas sensorvalk nimega Keap1, mis suunab selle pidevalt raku lagundamissüsteemi. Kui oksüdandid või elektrofiilid muudavad Keap1 reaktiivseid tsüsteiinijääke, lagundamine peatub. Äsja sünteesitud Nrf2 koguneb, liigub tuuma, moodustab paare väikeste Maf-valkudega ning seondub DNA järjestustega, mida nimetatakse antioksüdantse vastuse elementideks. See seondumine lülitab sisse terve hulga kaitsegeene.

Selle signaaliraja tüüpilised mõõdetavad näitajad on konkreetsed. NQO1 (NAD(P)H-kinooni dehüdrogenaas 1) ja TrxR1 (tioredoksiini reduktaas 1) kuuluvad kõige usaldusväärsemate Nrf2 sihtgeenide hulka. HO-1 (heemi oksügenaas-1) on tugevalt indutseeritav, kuid reageerib ka teistele regulaatoritele. Ensüümid nagu SOD ja katalaas kuuluvad antioksüdantsesse masinavärki, kuid nende taset kontrollivad paljud transkriptsioonifaktorid, seega ei tõenda SOD taseme tõus iseenesest, et põhjuseks oli Nrf2. Signaalisündmusele kõige lähemad tõendid on Nrf2 kogunemine tuumas, ARE-reporteri aktiveerumine või tüüpiliste sihtgeenide induktsioon, mis kaob Nrf2 eemaldamisel. Kõik muu — madalam oksüdantide tase, parem elulemus stressi korral, kõrgem glutatioonitase — on järgnev mõju, mida võivad tekitada paljud signaalirajad.

Selle loo varaseim metüleensinisega saadud tulemus paikneb selle skaala signaalisündmusele lähedases otsas. Nanomolaarse metüleensinisega kokku puutunud fibroblastides täheldati rakkude vananemise aeglustumist koos kompleksi IV suurema sisalduse, suurema hapnikutarbimise ning II faasi ensüümide TrxR1 ja NQO1 induktsiooniga, nagu kirjeldati uuringus, mis seostas esimesena metüleensinise mitokondrite talitluse paranemise ja rakkude vananemise aeglustumisega. TrxR1 ja NQO1 on just need tüüpilised Nrf2 sihtgeenid, mida hoolikas lugeja näha soovib. Uuring ei näidanud aga signaalisündmust ennast: ei mõõdetud Nrf2 sisaldust tuumas, ei kasutatud ARE-reporterit ega Nrf2 väljalülitamisega kontrollkatset. Seega on aus tõlgendus, et metüleensinine indutseerib selles süsteemis teadaolevaid Nrf2 sihtgeene. See on kooskõlas Nrf2 aktiveerumisega, kuid ei tõesta, et põhjuseks oli just Nrf2. Sihtgeeni induktsioon asub lülitist ühe sammu võrra allavoolu.

Biogeneesi mõiste: kolme kontrollpunktiga programm

Mitokondriaalne biogenees on programm, mille abil rakk suurendab oma mitokondriaalset võimekust. Selle õpikukohane hierarhia läbib kolm kontrollpunkti. Esiteks lülitab programmi sisse koaktivaator PGC-1alpha. Teiseks käivitavad tuuma transkriptsioonifaktorid mitokondriaalsete geenide ekspressiooni, sealhulgas TFAM-i ekspressiooni, mis tagab mitokondriaalse DNA säilimise ja replikatsiooni. Segadust tekitavalt kannab üks neist nime NRF1 ehk tuuma respiratoorne faktor 1, kuid see on Nrf2-st erinev valk. Kolmandaks on rakus lõpuks rohkem mitokondriaalseid genoome ja hingamismasinavärki, mida saab mõõta mtDNA koopiate arvu, tsitraadi süntaasi aktiivsuse või hingamisahela komplekside sisalduse ja aktiivsuse kaudu.

Iga kontrollpunkt toetab eelmisest nõrgemat või tugevamat väidet. PGC-1alpha või TFAM-i informatsiooni-RNA kõrgem tase näitab, et programmile anti käivituskäsk, mitte seda, et see viidi lõpule. Rohkem mtDNA-d või kompleksi IV valku näitab suuremat materjalikogust, kuid ümber kujundatud mitokondrid võivad anda samasuguse pildi. Parem hingamine, suurem hapnikutarbimine või komplekside aktiivsus näitab talitluse muutust, kuid talitlus võib paraneda ka ilma ühegi uue mitokondrita. Tugev biogeneesiväide ühendab kõik kolm: regulaatori, sisalduse ja talitluse.

Fibroblastide jätku-uuring läbis suurema osa sellest ahelast. Inimese IMR90 rakkudes, mida töödeldi 100 nanomolaarse metüleensinisega, tõusis NAD ja NADH suhe ajutiselt 15 minuti jooksul ning naasis ühe päeva jooksul algtasemele. Sellele ajutisele energiasignaalile järgnes energiasensori AMPK ajutine fosforüülimine, seejärel PGC-1alpha ja SURF1 induktsioon. SURF1 on valk, mida on vaja toimiva kompleksi IV kokkupanekuks. Kompleksi IV aktiivsus ligikaudu kahekordistus, rakkude oksüdantide tase langes umbes 28 protsenti ning telomeerid lühenesid aeglasemalt. Kogu sündmuste jada on kirjeldatud artiklis, mis seob metüleensinise redoksaktiivsuse AMPK ja mitokondriaalse biogeneesiga.

Selles artiklis väärivad tähelepanu kaks üksikasja, sest just sellised detailid jäetakse tavaliselt välja. Esiteks oli aktiveerumise muster olulisem kui aktiveerumise olemasolu: metüleensinine lülitas AMPK sisse ajutiselt, võrdlusravim AICAR aga püsivalt, ning ajutine aktivaator aeglustas rakkude vananemist umbes kaheksa korda tõhusamalt. Seega on väide „metüleensinine aktiveerib AMPK” puudulik; sisuline väide on, et see aktiveerib AMPK ajutiselt, ning võrdlus viitab sellele, et püsiv aktiveerumine ei anna sama tulemust. Teiseks ei muutnud metüleensinine rakutsüklit. See välistab kõige lihtsama alternatiivse seletuse: rakud lihtsalt jagunesid aeglasemalt ja paistsid seetõttu nooremad.

Hiirte uuringuharu: käitumine, genoomid ja teadlikult paradoksaalne käivitaja

Rakukultuuridega tehtud tööd laiendas loomkatsetele keskealisi hiiri uurinud rühm. Pärast 60 päeva kestnud suukaudset metüleensinise manustamist säilis ravitud hiirtel rohkem füüsilist vastupidavust ja uurimiskäitumist ning neil ilmnes vähem ärevuselaadset käitumist kui ravimata vanadel hiirtel. Ajukoes taastus vananemise tõttu vähenenud geenide NRF1, TFAM, SOD2 ja kompleksi IV alaühiku COX1 ekspressioon täiskasvanud loomade taseme suunas ning mtDNA koopiate arv suurenes. Need tulemused — käitumine koos regulaatori ja genoomide rohkusega — on esitatud keskealiste hiirte uuringus metüleensinise ja aju mitokondriaalse biogeneesi kohta.

Oletatav käivitaja on huvitav, sest see on vastuolus lihtsa käsitlusega metüleensinisest kui antioksüdandist. Ravitud hiirte aju mitokondrites suurenes reaktiivsete hapnikuühendite, täpsemalt vesinikperoksiidi teke. Autorite oletuse järgi aktiveerib nõrk peroksiidisignaal Nrf2 signaaliraja, mis omakorda käivitab biogeneesiprogrammi. Selles mudelis on metüleensinine käivitusetapis prooksüdant ja tulemuse etapis antioksüdant. Farmakoloogid nimetavad sellist mustrit hormeesiks: väike stress kutsub esile kaitsevastuse, mis on stressist endast suurem. Seda, kas peroksiiditaseme tõus tegelikult põhjustab Nrf2 aktiveerumise, otseselt ei kontrollitud; see on oletatav ühenduslüli, mitte mõõdetud seos.

Sama rühma kaasnevas uuringus kontrolliti selle oletuse ohutusega seotud külge. Isoleeritud aju mitokondrites suurendas metüleensinine vesinikperoksiidi tootmist juba 50 nanomolaarse kontsentratsiooni juures, kuid terapeutilised kontsentratsioonid ei põhjustanud mitokondriaalses DNA-s tuvastatavaid kahjustusi. Alles 100 mikromolaarse kontsentratsiooni juures, mis ületab terapeutilisi tasemeid kaugelt, ilmnesid valitud mtDNA fragmentides kahjustused. 20 mikromolaarse värvaine ja punase valguse kombinatsioon tekitas aga singlett-hapnikku, mis kahjustas mtDNA-d ulatuslikult. See on värvaine teadaolev toime fotosensibilisaatorina, mitte selle farmakoloogiline toime pimedas. Eeltöötlus kaitses isegi keskaju ventraalse osa mitokondreid rotenooni põhjustatud mtDNA kahjustuste eest. Annusest sõltuvat vastust ja genotoksilisuse kontrollkatseid kirjeldatakse üksikasjalikult uuringus metüleensinise põhjustatud mittegenotoksilise peroksiiditootmise kohta.

Mõõdetud ja oletatud: skeemi lugemine

Allolev signaaliraja skeem koostati selle artikli jaoks, et rõhutada tekstis läbivalt tehtud eristust. Pideva joonega raamitud kastid tähistavad etappe, millel on metüleensinise-alases kirjanduses otsene eksperimentaalne tugi: NAD/NADH suhet muutev redokstsükkel, AMPK ajutine fosforüülimine, PGC-1alpha ja SURF1 induktsioon, kompleksi IV suurem aktiivsus, NQO1 ja TrxR1 induktsioon, biogeneesiga seotud geenide ekspressiooni ja mtDNA koopiate arvu taastumine hiire ajus ning peroksiiditaseme tõus ilma mtDNA kahjustuseta terapeutiliste annuste korral. Katkendjoonega raamitud kastid tähistavad oletatavaid seoseid: peroksiidisignaali tajumine Keap1 poolt, Nrf2 kogunemine tuumas ja sellest tulenev kaitsegeenide aktiveerumine ning põhjuslik nool Nrf2 aktiveerumisest biogeneesiprogrammini. Need katkendjoonega märgitud etapid on usutavad, andmetega kooskõlas ja kuuluvad tavapärasesse õpikubioloogiasse, kuid neis artiklites ei mõõdetud neid selliste kontrollidega (Nrf2 sisaldus tuumas, ARE-reporterid, Nrf2 väljalülitamine), mis lubaksid need pideva joonega kastideks muuta.

Kui skeem on silme ees, ilmnevad kolm võimalikku segaduskohta. Esiteks on NRF1 ja Nrf2 eri valgud peaaegu identsete nimedega; hiirte uuringus mõõdeti tuuma respiratoorset faktorit 1, mis on biogeneesi regulaator, mitte antioksüdantset transkriptsioonifaktorit. Nende samastamine taandab kogu skeemi üheks sõlmeks. Teiseks on geeniekspressioon loo algus, mitte lõpp; TFAM-i või COX1 informatsiooni-RNA taseme taastumine toetab biogeneesi käivituskäsu olemasolu, samas kui mtDNA koopiate arv ja kompleksi IV aktiivsus on tõendid selle käsu täitmisest. Kolmandaks ei tõenda antioksüdantne tulemus Nrf2 kaudu kulgevat rada; oksüdantide taseme 28-protsendiline langus fibroblastides ja kaitse rotenooni eest hiirtel on tegelikud järgnevad mõjud, kuid nendeni jõuab mitu eri signaalirada.

Mis muudaks katkendjoonega kasti pideva joonega kastiks

Puuduvad katsed on tavapärased. Nrf2 valgu mõõtmine tuumas pärast kokkupuudet metüleensinisega, ajaliselt kooskõlastatuna ajutise AMPK signaaliga, kontrolliks, kas mõlemad harud tõepoolest aktiveeruvad koos, nagu väidab sünkroonse aktiveerumise hüpotees. ARE juhitav reporter kinnitaks transkriptsioonilist aktiivsust, selle asemel et seda sihtgeenide põhjal järeldada. Biogeneesi näitajate korduv mõõtmine Nrf2 vähendatud ekspressiooni või täieliku väljalülitamise korral kontrolliks põhjuslikku noolt otseselt: kui kompleksi IV induktsioon ja mtDNA suurenemine püsivad ka ilma Nrf2-ta, on oletatav ühenduslüli vale ning mõju vahendab üksnes AMPK haru. Loomkatsetes kontrolliks pikaajalise manustamise uuring samade kolme kontrollpunktiga — regulaator, sisaldus, talitlus — seda, kas programm jääb aktiivseks või kohaneb. Seni jääb energia- ja kaitseradade sünkroonne aktiveerumine selleks, milleks autorid seda nimetasid: võimalikuks võtmeteguriks, mitte tõendatud mehhanismiks.

Lugejad, kes lähtuvad laiemast farmakoloogilisest käsitlusest, võivad soovida lisakonteksti: kuidas metüleensinine kannab mitokondrite tasandil elektrone üle, mida muud see mitokondrite ja rakuenergeetikaga teeb, milline koht on rakkude vananemist puudutavatel leidudel vananemisuuringutes, kuidas biogeneesiväited seostuvad kognitiivse võimekusega ning millised ohutusandmed seavad piirid igale annustamisarutelule. Igaüks neist on eraldi mõiste oma tõenditega ning väärib samasugust mõõdetu ja oletatu eristamist, nagu selles artiklis tehti Nrf2 puhul.