Metüleensinine ja neurotransmitterid: serotoniin, dopamiin, GABA ja atsetüülkoliin

Metüleensinise kohta öeldakse sageli, et see suurendab serotoniini ja dopamiini taset, rahustab GABA kaudu ning teravdab atsetüülkoliini toimet — kõike korraga. See lause käsitleb nelja eraldi laborileidu ühe toimena inimese organismis. Selle aluseks olevad teadustööd mõõtsid erinevaid sihtmärke erinevates katsepreparaatides ja kontsentratsioonidel, mis erinevad ligikaudu tuhat korda. Kui sihtmärgid eraldi vaatluse alla võtta, muutub pilt korraga nii huvitavamaks kui ka ettevaatlikumaks, kui see üks lause võimaldab.

Lähteidee on lihtne. Molekul, mis seondub katseklaasis ensüümiga, on teinud üht: seondunud katseklaasis ensüümiga. Kas see muudab neurotransmitteri taset elavas ajus, sõltub koesse jõudvast kontsentratsioonist, molekuli keemilisest vormist kohale jõudes ning kõigist muudest toimetest, mida molekul samal kontsentratsioonil avaldab. Igas alljärgnevas jaotises käsitletakse neid kolme küsimust koos leiuga, mille juurde need kuuluvad.

Serotoniin: kaks sihtmärki, kaks kontsentratsiooni

Neist neljast süsteemist on serotoniini kohta kõige tugevam tõendus ning see pärineb kahest eraldi molekulaarsest sihtmärgist, mida ei tohiks kokku sulatada.

Esimene sihtmärk on A-tüüpi monoamiini oksüdaas, mitokondriaalne ensüüm, mis lagundab serotoniini. Metüleensinine inhibeerib puhastatud inimese MAO-A-d tihedalt seonduva inhibiitorina, mille Ki on ligikaudu 27 nanomolaarne, samas kui MAO-B mõjutamiseks on vaja palju suuremaid kontsentratsioone, nagu näitas kineetiline uuring, mis seostas värvaine serotoniinitoksilisusega. Seotud uurimissuund leidis sama selektiivsuse roti käbikehakoe puhul: MAO-A blokeerimine suurendas serotoniinist pärinevate indoolide hulka, vähendas serotoniini metaboliidi 5-HIAA taset ning muutis konnadel serotoniiniga seotud pöördumisrefleksi, nagu kirjeldati redoksvärvainete ja käbikeha indoolide uuringus. Kaks erinevat katsepreparaati, sama suund: vähem lagundamist ja rohkem säilinud serotoniini seal, kust ensüüm oleks selle muidu eemaldanud.

Teine sihtmärk on serotoniini transporter ise. Inimese transporterit ekspresseerivates rakkudes vähendas metüleensinine nii fluorestseeruva substraadi kui ka märgistatud serotoniini tagasihaaret, IC50 oli ligikaudu 1.4 mikromolaarne. Samuti pärssis see serotoniini esile kutsutud voole patch-clamp-mõõtmistes, nagu näitas metüleensinise toime otsene iseloomustamine SERT-il. Autorid kontrollisid ilmseid alternatiivseid seletusi ning leidsid, et toime ei sõltunud cGMP-signalisatsioonist, kaltsiumitaseme muutustest ega transporteri ekspressioonist rakupinnal.

Pange tähele nende kahe arvu erinevust. MAO-A inhibeerimine toimub nanomolaarsetel kontsentratsioonidel. Transporteri inhibeerimiseks on vaja ligikaudu viiskümmend korda rohkem värvainet. Väike ekspositsioon, mis ensüümi täielikult mõjutab, võib transporterile vaevu mõjuda. Nende ühendamine üheks serotoniini puudutavaks väiteks taandab kaks erinevat annusevahemikku üheks.

Kas kumbki sihtmärk on oluline inimese puhul, kes võtab teisi serotonergilisi ravimeid, on ravimikasutuse küsimus ning kuulub ravimite koostoimete juhendi juurde. See artikkel kaardistab sihtmärgid; kliinilised nõuanded on sellel teisel lehel.

Dopamiin: kõige nõrgem otsene tõendus

Dopamiini puhul nõuab ausus kõige suuremat vaoshoitust. Puudub hästi kinnitatud uuring, mis näitaks, et metüleensinine blokeerib dopamiini transporterit või seondub otseselt dopamiiniretseptoritega. Sageli tsiteeritud transporteri IC50 väärtus 1.4 mikromolaarset kuulub serotoniini transporterile, mitte DAT-ile, ning seda ei tohiks kunagi ümber omistada.

Olemasolev tõendus on hoopis kaudne. Kuna MAO ensüümid metaboliseerivad ka dopamiini, aitab MAO inhibeerimine säilitada dopamiini koos serotoniini ja noradrenaliiniga. Mitokondripreparaatides blokeeris metüleensinine neurotoksiini MPTP MAO-B vahendatud muundumise dopaminergiliseks mürgiks toime tugevusega, mis oli võrreldav Parkinsoni tõve ravimi deprenüüliga, nagu kirjeldavad MPTP bioaktiveerimise uuring ja seotud MAO-B uuringud. Loomkatsed lisavad üksikuid leide: ligikaudu kolmekordne suurenemine dopamiini basaalses vabanemises roti juttkeha lõikudest kontsentratsioonil 10 mikromolaarset, mida uuriti lämmastikoksiidi signalisatsiooni, mitte transporteri blokeerimise kontekstis, ning erinevad piirkondlikud tulemused pärast süsteemset manustamist. Mõnes uuringus suurenesid serotoniini ja noradrenaliini tasemed, samal ajal kui dopamiini tase muutus vaevu.

Seega on dopamiiniga seotud tõendus olemas, kuid kaudne. See kulgeb ensüümi kaudu, mis töötleb korraga mitut monoamiini, mitte dopamiinispetsiifilise sihtmärgi kaudu. Iga väide, et metüleensinine suurendab inimestel dopamiini taset, jätab vahele etapi, kus seda oleks tegelikult näidatud.

GABA: piduri blokeerimine seondumistaskus

GABA kohta tehtud leid on täpne ning läheb vastuollu värvaine mainega. Inimese GABA-A retseptoreid ekspresseerivates rakkudes inhibeeris metüleensinine GABA esile kutsutud voole alates ligikaudu 3 mikromolaarsest kontsentratsioonist. Levinud alpha1-beta2-gamma2 konfiguratsiooni IC50 oli ligikaudu 31 mikromolaarset, nagu näitas toimekoha kaardistanud elektrofüsioloogiline uuring.

Kõige väärtuslikum osa on toimekoha kaardistamine. Mutatsioonid pikrotoksiini seondumiskohas jätsid inhibeerimise puutumata ning alaühikute võrdlemisega välistati bensodiasepiini ja tsingi seondumiskohad. Seevastu mutatsioonid kahes aminohappejäägis, mis teadaolevalt moodustavad GABA enda seondumistasku, vähendasid blokeerimist järsult. See osutab konkureerivale antagonismile agonisti seondumiskohas, mitte allosteerilisele modulatsioonile mujal. Toime säilis nii sünaptilistes kui ka ekstrasünaptilistes alaühikukombinatsioonides ning kadus värvaine väljapesemisel kiiresti.

See tekitab tõelise vastuolu, mida tasub selgelt sõnastada. Molekul, mida uuritakse mälu toetamise eesmärgil, pärsib ühtlasi kiiret inhibeerivat ülekannet katseanumas. Kas selline pärssimine toimub elavas ajus, sõltub kohalikust kontsentratsioonist. 31 mikromolaarset on suurem kui enamik süsteemseid ekspositsioone; seda käsitletakse viimases jaotises. Leid ongi see vastuolu ise; selle lahendamiseks oleks vaja katseid, mida pole tehtud.

Atsetüülkoliin: kaks vastassuunalist toimepunkti

Atsetüülkoliini kohta on kaks vastassuunalist leidu ning just seetõttu tuleb neid eraldi esitada.

Ühelt poolt inhibeerib metüleensinine ensüüme, mis eemaldavad atsetüülkoliini. Veise erütrotsüütide atsetüülkoliinesteraasi inhibeeriti konkureerivalt ligikaudu 0.57 mikromolaarsel kontsentratsioonil, veise ensüümi ligikaudu 0.42 mikromolaarsel kontsentratsioonil ning inimese plasma esteraasi aktiivsust ligikaudu 1.1 mikromolaarsel kontsentratsioonil. Butürüülkoliinesteraasi inhibeeriti ligikaudu 0.4 kuni 5.3 mikromolaarsetes kontsentratsioonides sõltuvalt liigist ja katsepreparaadist, nagu võtab kokku ülevaade metüleensinise toimetest närvisüsteemis. Eemaldamise aeglustumine jätab sünapsi rohkem virgatsainet — sama põhimõte on mitme heakskiidetud Alzheimeri tõve ravimi aluseks.

Keemilise toimega kaasneb aga tingimus. Oksüdeeritud sinine vorm inhibeerib ensüümi; redutseeritud värvitu vorm seda ei tee. Pikad inkubatsioonid, mille jooksul värvaine saab redutseeruda, annavad juba ainuüksi sel põhjusel nõrgema inhibeerimise tulemuse. Iga koliinesteraasi katsetulemust saadab varjatud muutuja: kui suur osa värvainest oli mõõtmise ajal endiselt sinine.

Teiselt poolt blokeerib metüleensinine alpha7 nikotiinretseptorit, üht retseptoritest, millele atsetüülkoliin toimib. Konna ootsüütides ekspresseeritud inimese alpha7 retseptoreid inhibeeriti IC50 väärtusega ligikaudu 3.4 mikromolaarset mittekonkureeriva, pingest sõltumatu antagonismi kaudu, mis jättis agonisti toime tugevuse muutumatuks. Kontsentratsioon 3 mikromolaarset kaotas koliini esile kutsutud sünaptilised vastused roti hipokampuse lõikudes, nagu kirjeldab alpha7 retseptori uuring. Seega säilitab värvaine sarnastel madalatel mikromolaarsetel kontsentratsioonidel virgatsainet ja nõrgendab samal ajal ühe selle retseptori toimet. Kogumõju kolinergilisele signalisatsioonile ei saa järeldada kummastki leiust eraldi. See ebaselgus seostub laiema Alzheimeri tõve alase teaduskirjandusega ning kognitsiooni ja haigusuuringute teemalise aruteluga, kuid siin see lahendust ei saa.

Võrdlus ühes kohas

Kõige tundlikumat sihtmärki eraldab kõige vähem tundlikust kolm suurusjärku. See vahemik võtab artikli ühes tabelis kokku.

Kas need kontsentratsioonid jõuavad ajju?

Katseklaasis mõõdetud arv ei tähenda midagi, kui selle kõrval puudub ekspositsiooni näitaja. Pärast ligikaudu 1.4 mg kilogrammi kohta intravenoosse boolusena manustamist on inimestel kirjeldatud keskmist plasmataset ligikaudu 5 mikromolaarset, samas kui samas teaduskirjanduses andis 100 mg suukaudne annus täisveres taseme ligikaudu 0.08 mikromolaarset. Rottidel tehtud jaotumise uuringutes on leitud ajus ligikaudu kümme kuni kakskümmend korda suurem tase kui vereringes. See on aga värvaine üldkogus homogeniseeritud koes, mitte vaba oksüdeeritud värvaine sünapsis. Ligikaudu 94-protsendiline seondumine plasmavalkudega ja jaotumine vererakkudesse vähendavad vaba fraktsiooni veelgi.

Tabeliga võrreldes on muster astmeline, mitte binaarne. MAO-A inhibeerimine toimub tavapärastest intravenoossetest ekspositsioonidest märksa madalamal tasemel ning on farmakoloogiliselt usutav, kui värvainet manustatakse sel viisil. Koliinesteraasi ja alpha7 toimed jäävad madalasse mikromolaarsesse vahemikku, millega intravenoossed tippkontsentratsioonid kattuvad, kuid milleni tavalised suukaudsed annused ei pruugi ulatuda. GABA-A IC50 väärtus 31 mikromolaarset on suurem kui enamik usutavaid süsteemseid ekspositsioone, mistõttu on just sellele blokeerimisele inimese organismis kõige raskem tugineda. Iga võrdlusrea puhul kehtib sama mööndus: asjakohane on vaba, oksüdeeritud, rakuvälise värvaine kontsentratsioon sihtmärgi juures — suurus, mida ükski vereproov otseselt ei mõõda.

Mida ei saa järeldada

Ükski tabeli rida ei tõenda, et metüleensinine suurendab või vähendab inimesel mõne neurotransmitteri taset prognoositaval viisil. Ensüümi inhibeerimine puhastatud preparaadis, transporteri blokeerimine rakuliinis ja retseptori antagonism koelõigus on igaüks sünapside tegelikust toimimisest ühe kontrollitud sammu kaugusel. Kolinergiline jaotis näitab, kuidas kaks tõest leidu võivad koos jätta tulemuse ebaselgeks. Selle lehe vastutustundlik kasutus on käsitleda seda kaardina sihtmärkidest, millega molekuli seondumist on näidatud, koos märgitud seondumistugevusega, et arutelu mehhanismide üle püsiks tegelikult mõõdetu juures. Seda, kuidas need sihtmärgid suhestuvad retseptiravimitega, käsitleb koostoimete juhend. Lisakonteksti pakuvad farmakoloogia aluste käsitlus ja kaasnev mehhanismide selgitus.