Miks kasutatakse metüleensinist happekindla värvingu vastuvärvina

Laborant uurib rögapreparaati pärast kogu värvimisprotseduuri. Sinisel taustal eristuvad punased pulkbakterid ning vastuseks märgitakse, et nähti happekindlaid batsille. Järgmisel päeval on teisel alusklaasil ühtlane sinine väli ilma punaste pulkbakteriteta ning vastuseks märgitakse tuberkuloosi suhtes negatiivne tulemus. Üks neist vastustest väidab rohkem, kui preparaat tõendab, ja see ei ole esimene.

Segadus tuleneb põhimõtte valest mõistmisest. Laborant käsitles sinist värvainet tuvastamise keemia osana, justkui aitaks metüleensinine mükobaktereid leida. Nii see ei ole. Selleks ajaks, kui metüleensinine alusklaasile jõuab, on katse juba lõppenud. Värvaine värvib üksnes tausta, et tulemus oleks loetav. See artikkel selgitab metüleensinise otstarvet happekindlal värvimisel, miks kasutatakse just sinist, mitte mõnda muud värvi, ning milliseid järeldusi lubab teha punane sinisel taustal.

Lühivastus

Happekindel värvimine on diferentsiaalne katse, mis põhineb kolmel põhimõttel. Põhivärv karboolfuksiin viiakse kõikidesse rakkudesse, sealhulgas vahaja kestaga mükobakteritesse. Värvitustaja happealkohol eemaldab punase värvaine tavalistest rakkudest, kuid ei suuda seda happekindlatest rakkudest välja viia. Seejärel värvib vastuvärv metüleensinine kõik selle, kust värvitustaja värvaine eemaldas. Nii paistavad mittehappekindlad rakud, peremeesrakud ja rakujäänused sinisena, happekindlad batsillid aga jäävad punaseks. Vastuvärv annab kontrasti. See ei osale keemilistes protsessides, mis muudavad raku happekindlaks.

Mida iga etapp teeb

Allolev skeem näitab ülesannete jaotust. Loe seda vasakult paremale kui protseduuri kirjeldust ning alumist riba kui meeldetuletust, et iga värvimismeetodite rühm vastab eri küsimusele.

Esmalt peab värvaine rakku tungima. Mükobakterid tõrjuvad tavalisi vesilahuselisi värvaineid, sest nende rakukest on ebatavaliselt hüdrofoobne, mistõttu protokoll näeb ette värvaine sisseviimise erimeetodil. Ziehl-Neelseni meetodis viib aurumiseni kuumutamine fenooli sisaldava karboolfuksiini läbi vahaja rakuseina. Kinyouni külmmeetodis asendab kuumutamist märksa tugevama koostisega põhivärv ning mõnes muudetud kuumutamiseta variandis lisatakse pindaktiivseid aineid. Ameerika Mikrobioloogia Seltsi happekindla värvimise protokollid kirjeldavad mõlemat koostist kõrvuti ning kontsentratsioonide erinevus on silmatorkav: kuumutatavas meetodis ligikaudu 0.3 g aluselist fuksiini 100 mL kohta, külmmeetodis aga umbes 4 g.

Teiseks toimub eristamine. Happealkohol, tavaliselt 3 mL kontsentreeritud soolhapet 97 mL 95-protsendilises etanoolis, uhub punase värvaine välja igast rakust, mille sein ei paku erilist vastupanu. Terve mükobakteriaalse lipiidkestaga rakud säilitavad värvaine. See on etapp, millele kogu meetod tugineb ja mis on teostuse suhtes kõige tundlikum, nagu allpool selgitatud.

Viimasena luuakse kontrast. Alusklaasil on nüüd punased happekindlad rakud peaaegu värvitul taustal, mille moodustavad värvainest tühjendatud rakud. Metüleensinine kontsentratsioonil 0.3 protsenti w/v muudab selle tausta taas nähtavaks punasest võimalikult erinevas värvitoonis. Vastuvärvimine on lühiajaline: kuumutatavas meetodis tavaliselt 20 kuni 30 sekundit ja mõnes külmmeetodi variandis kuni mõni minut. Kestus sõltub protokollist, mitte värvaine enda omadustest.

Miks just see värvaine ja miks sinine

Metüleensinine on katioonne aluseline värvaine: selle värviline ioon kannab positiivset laengut ning seondub värvitustatud bakterite, peremeesrakkude ja rakujäänuste negatiivselt laetud pindadega. OpenStaxi mikrobioloogiaõpik kirjeldab seda laengute koostoimet aluseliste värvide üldpõhimõttena. Metüleensinine ei ole aga selles keemiliselt ainulaadne. Ka kristallviolett ja safraniin on aluselised värvained. Valik põhineb optikal, mitte keemial.

Punased pulkbakterid vajavad kontrastset taustatooni ning sinine vastandub punasele heleväljamikroskoopia jaoks kõige kasulikumal viisil. Safraniin oleks kehv vastuvärv, sest selle roosakaspunane lõpptoon on säilinud karboolfuksiini värvusele liiga lähedane ja kaotaks just selle eristuse, mille protseduur lõi. Kristallviolett annaks tumelilla tausta, mis konkureeriks peenikeste punaste batsillidega tähelepanu pärast. Kõige tugevam tõend selle kohta, et ülesanne on kontrasti loomine, mitte keemiline toime, on asendatavus: mõnes veterinaarses ja muudetud protokollis kasutatakse rohelisi vastuvärve, näiteks malahhiitrohelist ja briljantrohelist, ning katse toimib endiselt, sest iga selgelt erinev värvitoon täidab sama ülesannet.

Sellest tuleneb kaks praktilist järeldust. Esiteks ei näe standardretsept ette pH reguleerimist; seda lihtsat 0.3-protsendilist vesilahust ei tohi segi ajada aluseliste koostistega, nagu Loeffleri metüleensinine, mis kuuluvad teise värvimispõhimõtte juurde. Teiseks teeb liigne värvimine kahju. Histoloogiaalane kirjandus hoiatab konkreetselt, et liiga intensiivne sinine taust võib varjata väheseid batsille. Seega halvendab alusklaasi hoidmine värvaine all kauem, kui protokoll lubab, loetavust ilma mingit kasu andmata.

Rakuseina keemia, mis teeb katse võimalikuks

Happealkoholi eristava toime põhjus peitub mükobakterite rakukestas. Selle struktuurne tuum on mükolüül-arabinogalaktaan-peptidoglükaankompleks: peptidoglükaan on seotud arabinogalaktaaniga, mille välimiste otste küljes on väga pika ahelaga mükoolhapped. Need moodustavad lipiidirikka välise mükomembraani, mille läbilaskvus on ebatavaliselt väike. Mükobakterite välismembraani ülevaade kirjeldab seda ehitust üksikasjalikult. Barjäär toimib mõlemas suunas. See takistab värvaine sisenemist, mistõttu rakku tungimiseks on vaja kuumutamist või tugevamat põhivärvi, ning takistab värvaine väljumist, mistõttu happealkohol ei suuda juba rakku jõudnud karboolfuksiini eemaldada. Tavalistel bakteritel selline kest puudub ja nad kaotavad värvaine. Seega on happekindlust kõige õigem mõista lipiidbarjääri nähtusena, mitte fuksiini keemilise seondumisena mükoolhappega.

See keemia selgitab ka levinud mõistatust: mükobakterid värvuvad Grami meetodil halvasti ja ettearvamatult, paistes vahel nõrkade helmestunud vormide või värvumata varikujudena. Nende hüdrofoobne sein piirab kristallvioleti sisenemist. Happekindel värvimine ei ole muudetud Grami värving. See on teistsugune diferentsiaalne põhimõte, mis tugineb rakuseina teisele omadusele, nagu näitab kahe muu meetodi puhul lihtvärvingu ja Grami värvingu võrdlus.

Kolm meetodit, kolm küsimust

Ühe värvainega bakterite värvimismeetodite laiema rühma kohta vaata mikroskoopilise värvimise atlast.

Mida punane sinisel taustal ei tõenda

Punased pulkbakterid tähendavad, et organismid säilitasid karboolfuksiini happealkoholiga töötlemisel. See leid on kooskõlas Mycobacterium tuberculosis’e esinemisega, kuid CDC tuberkuloosi diagnostika juhend märgib sõnaselgelt, et ka teised mükobakterid on happekindlad. Seetõttu nõuab liigi määramine külvi ja nukleiinhappeteste, mitte värvuse hindamist.

Teostusvead koonduvad kahe pesuetapi ümber. Ebapiisav värvitustamine jätab taustamaterjali punaseks ja soodustab valepositiivset tõlgendust. Liigne värvitustamine eemaldab nõrgalt säilinud põhivärvi ja soodustab valenegatiivseid tulemusi. Liiga intensiivselt rakendatud vastuvärv peidab vähesed batsillid sinise sisse. Paksud äigepreparaadid, sadestunud reaktiivid ja saastunud loputusvesi lisavad omakorda artefakte.

Tundlikkust piirab organismide hulk, olenemata sellest, kui korrektselt meetodit kasutatakse. Tavapärane äigepreparaadi mikroskoopia vajab ligikaudu 5,000 kuni 10,000 batsilli ühe milliliitri röga kohta ning CDC varasemates tõendusülevaadetes hinnati äigepreparaadi tundlikkuseks külviga kinnitatud kopsutuberkuloosi juhtudel umbes 45 kuni 80 protsenti. Seetõttu ei välista negatiivne äigepreparaat kunagi tuberkuloosi. CDC praegused juhised näevad iga äigepreparaadi kõrval ette ka külvi ning soovitavad nukleiinhappe amplifikatsioonitesti vähemalt ühest hingamisteede proovist, kui kahtlustatakse kopsutuberkuloosi ja tulemus muudaks käsitlust.

Praktilises töös tuleb järgida kinnitatud protokolle

Õppeotstarbelised kirjeldused, sealhulgas see artikkel, ei anna alust kliiniliseks tööks. Laboritöös järgi labori valideeritud standardset tööjuhendit, mis on kooskõlas CDC, APHL-i või CLSI kehtivate dokumentidega; CDC Stacks-arhiivis olev happekindla värvimise juhend näitab, kuidas sellised protseduurid määravad reaktiivid ja tulemuste hindamise. Tuberkuloosiproovidega töötamine nõuab bioloogilist ohjeldamist: äigepreparaadid valmistatakse bioohutuskapis, sest valmistamisel tekivad aerosoolid ja pritsmed. CDC laboriohutuse juhend märgib, et isegi kuumusega fikseeritud äigepreparaadid võivad sisaldada eluvõimelisi tuberkuloosibatsille ning neid tuleb endiselt käsitleda saastununa. CDC rahvatervise pildikogu kirje karboolfuksiini ja metüleensinisega värvitud äigepreparaadi kohta, mida uuriti M. leprae leidmiseks, tuletab kasulikult meelde, et meetodi kasutusala ulatub tuberkuloosist kaugemale: sama punase ja sinise kontrast toimib kõikjal, kus otsitakse happekindlaid organisme, ning hoolikalt hinnatud negatiivne leid on samuti tulemus, mis väärib dokumenteerimist.

Valmis preparaadi hindamine

Vastuvärv õigustab oma kasutamist esmase ülevaatuse ajal. Väikese suurendusega preparaati läbi vaatav mikroskopist kasutab sinist tausta kõigepealt äigepreparaadi kvaliteedi hindamiseks: rakkude ühtlane jaotus, terved peremeesrakud teravustamiseks ja rohke sademe puudumine. Seejärel köidavad punased võimalikud batsillid pilku just seetõttu, et miski muu alusklaasil ei ole punane. Leid kinnitatakse õliimmersiooniga, mille korral tõelised batsillid paistavad ootuspäraste peenikeste, mõnikord veidi kõverdunud või helmestunud pulkadena, mitte ühtlase värvaineprügina.

Tausta värvimine määrab ka vastuse sõnastuse. Punaste batsillidega preparaadi kohta märgitakse, et nähti happekindlaid batsille, sageli koos poolkvantitatiivse hinnanguga labori skaala järgi. Preparaadi kohta, kus punaseid organisme ei ole, märgitakse, et happekindlaid batsille ei nähtud, mitte kunagi, et tulemus on tuberkuloosi suhtes negatiivne. See eristus on oluline, sest sinine väli tõendab, et värvimine toimis, rakud võtsid vastuvärvi vastu ja optika oli piisav, kuid ei ütle midagi allpool tuvastuspiiri olevate organismide kohta. Punaste batsillideta sinine väli on kehtiv tulemus preparaadi kohta, mitte otsus patsiendi kohta.

Pea meeles ülesannete jaotust ning vastuse sõnastus tuleb iseenesest. Karboolfuksiin toob esile võimalikud batsillid. Happealkohol teeb katse. Metüleensinine muudab vastuse ainult loetavaks: punane säilitas värvaine happe toimel, sinine kaotas selle. Kõik muu — liik, organismide hulk ja kliiniline tähendus — selgub uuringutest, mis jäävad selle preparaadi vaatlemisest väljapoole.