Metüleensinine ja autofaagia: AMPK, mTOR ja neuronitega tehtud katsed

Kujutlege, et teete rakukatset, lisate metüleensinist ja näete, et LC3-II-nimelise valgu vööt muutub immunoblotil tumedamaks. On ahvatlev kuulutada, et ühend „võimendab autofaagiat”, ja sellega piirduda. Selline tõlgendus on ennatlik. Tumedam LC3-II vööt võib tähendada, et rakk moodustab rohkem puhastusvesiikuleid, kuid see võib tähendada ka vesiikulite kuhjumist, sest kõrvaldamisetapp on takerdunud. Need kaks tõlgendust osutavad vastassuundadesse ning neuronite ja metüleensinise kohta avaldatud kirjanduses leidub mõlemat liiki tõendeid. See artikkel käsitleb analüüsimeetodite kaupa, mida tegelikult mõõdeti.

Makroautofaagia, mida siin uuriti, on raku materjalide ulatusliku ringlussevõtu protsess. Fagofooriks nimetatav membraanikott kasvab kulunud valkude ja organellide ümber, sulgub autofagosoomiks, ühineb lüsosoomiga ning selle sisu lagundatakse ja vabastatakse taaskasutuseks. Neuronid sõltuvad sellest protsessist, sest nad ei jagune ega saa kahjustatud osade osakaalu jagunemise teel vähendada. Kui ringlussevõtt takerdub, kogunevad jäägid. Kui see toimib, saab rakk stressi korral ehitusmaterjale tagasi.

Mida näitas üks hipokampuse rakkudega tehtud katse

Keskses autofaagia indutseerimise uuringus kasutati hiire hipokampuse HT22 rakke, mida hoiti 24 tundi seerumita. Selline tingimus jätab rakud ilma kasvufaktoritest ja troofilistest signaalidest ning käivitab nii apoptoosi kui ka autofaagia. Teadlased teatasid, et metüleensinine vähendas rakusurma annusest sõltuvalt ning selle kaitsega kaasnesid makroautofaagia tunnused.

Markerite muutused olid konkreetsed. LC3B hajus värvumismuster jaotus ümber tuumaümbruse täppideks alates ligikaudu 20 nM metüleensinisest, kusjuures LC3-I ja LC3-II tugevaim vastus ilmnes 1 μM lähedal. Nii LC3B-I kui ka LC3B-II suurenesid annusest ja ajast sõltuvalt. Oluline on, et uurimisrühm läks staatilisest LC3 immunoblotist sammu võrra kaugemale. Nad lisasid 10 μM klorokiini, mis blokeerib lüsosomaalset kõrvaldamist, ning leidsid metüleensinisega töödeldud rakkudes kõrgema LC3-II taseme ja stabiliseerunud p62. See muster toetab lüsosoomidest sõltuvat käivet, mitte pelgalt kuhjumist. Samuti näitasid nad, et klorokiin vähendas osaliselt apoptoosivastast toimet, mis seob selles mudelis kaitse autofaagia ja lüsosoomide rajaga.

Signaaliülekande tulemust tsiteeritakse kõige sagedamini valesti. AMPK signaaliülekanne, mida hinnati fosforüülitud AMPK ja selle allavoolu sihtmärgi fosforüülitud ACC kaudu, suurenes 12 ja 24 tunni järel annusest sõltuvalt. AMPK inhibiitor Compound C, mida kasutati viimase 4 tunni jooksul kontsentratsioonil 20 μM, vähendas nii ACC fosforüülimist kui ka LC3 aktiveerumist. Fosforüülitud mTOR-i puhul ei täheldatud seevastu tuvastatavat pärssimist. Seega leiti stressis hipokampuse rakkudes AMPK-ga seotud indutseerimine näiliselt mTOR-ist sõltumatu raja kaudu. Sama muster ilmnes elus hiirtel, kus metüleensinisega töötlemine indutseeris makroautofaagia markereid ajukoores ja hipokampuses.

Indutseerimine ei tähenda lõpule viidud autofaagilist voogu

Siin on mõistete eristamine eriti oluline. Indutseerimine tähendab, et protsessi eelnev masinavärk toodab rohkem autofagosoome. Voog tähendab, et last läbib kogu teekonna: eraldamise, küpsemise, lüsosoomiga ühinemise, lagundamise ja ringlussevõtu. Iga LC3-II suurenemine annab alust üksnes indutseerimise väiteks, kuni voo test kinnitab ka ülejäänud teekonda.

Standardne voo test mõõdab LC3-II taset nii lühiajalise lüsosomaalse blokaadi korral, näiteks bafilomütsiin A1 või klorokiiniga, kui ka ilma selleta. Kui töötlus tõepoolest kiirendab tootmist, peaks lagundamise blokeerimine tõstma LC3-II taset veelgi. Tandemreporter mCherry-GFP-LC3 lisab teise vaatenurga: enne lüsosoomiga ühinemist helendavad struktuurid kollaselt ning pärast seda, kui happeline keskkond GFP signaali kustutab, ainult punaselt. Seega toetab ainult punaste täppide hulga suurenemine jõudmist happelistesse autolüsosoomidesse. p62 valgu taseme langus võib kinnitada lasti käivet, kuid tuleb arvestada, et ka p62 transkriptsioon reageerib stressile ning seda tuleks kontrollida mRNA tasemel.

Allolev kontrollnimekiri seob iga selles kirjanduses kasutatud analüüsimeetodi sellega, mida see mõõdab ja mida see üksi tõestada ei saa. Lugejad võivad seda kasutada mis tahes tulevase makroautofaagiaväite hindamisel, sealhulgas paastumist ja pikaealisust käsitlevate argumentide puhul, mis tuginevad neile markeritele.

Pange tähele üht sõnastuslõksu, mille eest tabel kaitseb. Fosforüülitud ACC on ensümaatiliselt pärsitud vorm. Selle suurenemine näitab AMPK väljundit, mitte ACC aktiveerumist.

Väljend „makroautofaagia pärssimine kaotas neuroprotektsiooni” nõuab sama täpsust. HT22 mudelis tähendab see, et autofaagia ja lüsosoomide raja häirimine kaotas metüleensinise antud ellujäämiseelise seerumipuuduse korral. See toetab autofaagia vajalikku või kaasaaitavat rolli selles rakukultuuris. See ei tõesta, et autofaagia on ühendi ainus kaitsemehhanism, ega seda, et klorokiin toimib ainult autofaagia kaudu. Põhjusliku väite tugevdamiseks oleks vaja ATG5, ATG7 või ULK1 geneetilist mõjutamist.

Kaks rada sama masinavärgini

Abiks on lihtsustatud skeem. Energiastress suurendab AMPK aktiivsust, AMPK aktiveerib ULK1 kompleksi ning autofaagia käivitub. Kasvufaktorid ja toitained suurendavad mTORC1 aktiivsust, mTORC1 pärsib ULK1 ning autofaagia jääb käivitumata. ULK1-st allavoolu algatab Beclin-1 ja VPS34 kompleks fagofoori tekke, LC3-I lipideeritakse LC3-II-ks, autofagosoom sulgub ja ühineb lüsosoomiga ning last lagundatakse koos p62 käibega.

Skeem paigutab iga metüleensinise leiu sellele kaardile: hipokampuse tulemuse AMPK haru juurde ja eellasrakkude tulemuse mTOR-i haru juurde.

Selline käsitlus lahendab näilise vastuolu teise Xie uuringuga. Paljunevates roti neuraalsetes eellasrakkudes leiti eraldi katses, et 5 μM metüleensinist pärssis proliferatsiooni ja soodustas puhkeseisundit: Ki67-positiivsete rakkude hulk vähenes päevadel 1 ja 3, samal ajal kui neuroniteks diferentseerumisele suunatud rakkude diferentseerumine säilis. Seal toimis mehhanism mTOR-i signaaliülekande pärssimise kaudu: mTOR-i üldtase ja fosforüülitud mTOR vähenesid koos p70S6K ja 4EBP1 ekspressiooni langusega ning tsükliinide E1, B1, D1 ja D2 allareguleerimisega. Valdav fenotüüp oli eellasrakkude puhkeseisund, mille autorid seostasid rakulise vananemise edasilükkumisega, mitte stressis hipokampuse rakkude päästmisega.

Kahe artikli vahel ei ole vastuolu. AMPK ja mTOR on kontekstitundlikud signaalide integraatorid, mitte fikseeritud lülitid. Stressis neuronilaadne rakk võib rakendada AMPK-d ilma mõõdetava mTOR-i pärssimiseta, samal ajal kui mitogeenidest mõjutatud eellasrakk võib samale ühendile vastata mTOR-ist sõltuva kasvumasinavärgi aeglustamisega. Rakutüüp, stressikontekst, kontsentratsioon ja mõõtmise ajahetk määravad, milline haru domineerib. Seetõttu kuuluvad samasse pilti ka metüleensinise mõjud mitokondrite energiatalitlusele ja redoksprotsessidele: nagu kirjeldab neuroprotektsiooni mehhanismide ülevaade, toimib ühend alternatiivse elektronikandjana, rakendab antioksüdatiivset ja apoptoosivastast signaaliülekannet, pärsib MAO-d ja NOS-i ning seostub mitokondrite uuenemisega biogeneesi ja autofaagia kaudu. Autofaagia on mitmetoimelise profiili üks haru, mitte kogu lugu.

Mida katsed ei näita

Seerumi eemaldamine modelleerib rakukultuuris troofilist ja metaboolset stressi. See ei modelleeri terve organismi paastumist: glükoos, aminohapped ja soolad jäävad põhisöötmesse ning toitumiskäitumine puudub. Rakukultuuris kasutatud kontsentratsioone vahemikus 20 nM kuni 5 μM ei saa aritmeetiliselt teisendada inimese annusteks, sest imendumine, valkudega seondumine, redoksseisund, ainevahetus, kudedesse kogunemine ja kokkupuute kestus on kõik erinevad.

Ühtegi inimuuringut ei ole kavandatud selleks, et näidata metüleensinise indutseeritud autofaagilist voogu patsientidel. Mehhanistlikud tõendid piirduvad endiselt rakukatsete, ex vivo uuringute ja loomkatsetega ning ülevaated kirjeldavad tulemuste kliinikusse ülekandmist toetavaid tõendeid endiselt esialgsetena. Seega ei näita need uuringud, et metüleensinine jäljendaks paastumist, pikendaks autofaagia kaudu inimese eluiga või viiks autofaagilise voo inimese ajus lõpule. Paastumist jäljendavad ja pikaealisust puudutavad väited vajavad oma kliinilisi tõendeid ning metüleensinise inimuuringud muude näidustuste puhul ei muutu pelga seose tõttu autofaagiauuringuteks. Toitainepuudusest tingitud stressi ja pikaealisuse mudelite uuringuid tuleks lugeda seda piiri silmas pidades.

Järgmist artiklit lugedes kasutage kontrollnimekirja järjekorras. Esmalt küsige, milline haru muutus: AMPK, mTOR või mitte kumbki. Seejärel küsige, kas LC3 tulemusega kaasnes voo test või jäi see eraldiseisvaks. Siis kontrollige, kas raja blokeerimine kaotas kasuliku mõju ja millist meetodit selleks kasutati. Uuring, mis vastab kõigile kolmele küsimusele, annab aluse tugevale mehhanistlikule väitele. Uuring, mis vastab ainult esimesele, on näidanud lubavat signaali ning ülejäänud teekond on endiselt kaardistamata.