Artikkel
Metüleensinine anaeroobse ja hapnikuindikaatorina: mida värvimuutus tõendab
Laborant sulgeb anaeroobse anuma, kontrollib metüleensinise indikaatorriba läbi kaane ja näeb soovitud tulemust. Riba on muutunud sinisest valgeks. Ta märgib katse anaeroobseks ja jätkab tööd. Kaks päeva hiljem ei kasva ühel söötmeplaadil midagi, samal ajal kui sama anuma sees olevas suletud puljongiga katseklaasis on märke hapnikuga kokkupuutest. Riba näitas tõtt. Laborant küsis sellelt vale küsimuse.
Segadus tuleneb mõistete segiajamisest. Metüleensinise anaeroobne indikaator põhineb redoksil, mitte steriilsusel ega kogu süsteemi valideerimisel. Kui see erinevus on selge, saab ribast täpne ja usaldusväärne vahend, millel on kitsalt piiritletud ülesanne.
Põhimõte: pöörduv redokspaar
Lahustunud metüleensinine esineb kahes olekus. Oksüdeerunud vorm on tuttav sinine katioon. Redutseerunud vorm, mida nimetatakse leukometüleensiniseks, on värvitu. Neutraalse lähedase pH korral annab lihtsustatud poolreaktsioonis üks sinine katioon koos ühe prootoni ja kahe elektroniga ühe värvitu leukovormi molekuli. Formaalpotentsiaal on pH 7 juures standardvesinikelektroodi suhtes ligikaudu pluss 11 millivolti. See jääb vahemikku, milleni paljud redutseerivad süsteemid suudavad jõuda ja mille hapnik saab tagasi pöörata.
Redutseerumine vajab madalat kohalikku redokspotentsiaali. Üksnes hapniku eemaldamisest ei pruugi piisata. Varastes anaeroobioosi uuringutes leiti, et metüleensinine säilitas tavalises hapnikuvabas vees oma värvuse, kui puudus redutseeriv aine. Samuti kaotasid dekstroosipuljongi ja ligikaudu 0.01 protsendi värvaine segud 37 C juures kiiresti värvuse, kuid sama segu püsis 4 C juures päeva jooksul sinisena, nagu kirjeldati värske koe ja anaeroobsete kultiveerimistingimuste katsetes. Temperatuur, pH, glükoos, askorbaat, tioglükolaat ja mikroobide redutseeriv aktiivsus määravad kõik selle, kas elektronid on kättesaadavad.
Taasoksüdeerumiseks piisab hapnikust. Kui õhk jõuab leukovormini, muutub see uuesti siniseks. Tänapäevased spetsiaalselt välja töötatud indikaatorid kasutavad täpselt seda tsüklit: värvaine koos redutseerija ja stabiliseeriva maatriksiga on vähese hapniku korral värvitu ning muutub õhuga kokkupuutel uuesti siniseks. Seda demonstreeriti värvainel, redutseerijal, pindaktiivsel ainel ja savil põhineva metüleensinise hübriidse hapnikuindikaatoriga. Selles prototüübis kasutati 0.01 millimolaarset värvainet koos 2.0 millimolaarse askorbaadi või glükoosiga pH 11 juures. Indikaator muutus värvituks ligikaudu 0.5 mahuprotsendi hapniku juures ning eristas katsekambris alla 0.1 protsendi jäävat hapnikusisaldust üle 0.5 protsendi ulatuvast hapnikusisaldusest.
Tööpõhimõte on seega lihtne. Sinine tähendab, et indikaatori piirkond on oksüdeerunud. Värvitu tähendab, et indikaatori piirkonnas on saavutatud redutseerivad, vähese hapnikuga tingimused. Muutus on pöörduv, lokaalne ja keemiline. Iseenesest ei ütle see mikroobide kohta midagi.
Kuidas metüleensinise indikaatorriba anaeroobses anumas töötab
Anaeroobse anuma metüleensinise indikaatorriba on väike reaktsioonipiirkond, mis paigutatakse anuma gaasikeskkonda nii, et seda saab näha anumat avamata. Müügil olevad vormid erinevad: paberiribad, ettevalmistamisel lahustatavad või niisutatavad tabletid ning uuemad hübriidpaberid. Mõned vajavad reaktsioonipiirkonna aktiveerimiseks üht tilka destilleeritud vett. Teised on kuivad indikaatorid, mis peavadki kuivaks jääma. Määrav on konkreetse toote kasutusjuhend, sest niisutamine, paigutus ja lugemise aeg on keemilise protsessi osad.
Praktikas on ettenähtud tõlgendus kahene. Sinine tähendab, et riba juures püsib hapnik või pole tingimused piisavalt redutseerivad. Valge või värvitu tähendab, et riba juures on saavutatud anaeroobsed redokstingimused. Mõnele müügil olevale indikaatorpaberile on lisatud punane taustpigment, mistõttu nende redutseerunud lõppolek on valge asemel roosa. Enne tulemuse hindamist tehke kindlaks, millist lõppvärvust teie toode ette näeb.
Ajastus sõltub süsteemist. Ühes GasPaki tüüpi süsteemis algas värvuse kadumine umbes tunni jooksul ja jõudis lõpule mõne tunniga, kuid kontrollitud võrdluses toatemperatuuril kulus metüleensinisel üle kuue tunni. Selles uuringus langes söötme redokspotentsiaal 60 kuni 100 minuti jooksul ligikaudu miinus 100 millivoldini, ammu enne värvaine muutuse lõppemist, ning oli riba täielikult värvituks muutumise ajaks tunduvalt alla miinus 200 millivoldi. Indikaator reageerib gaasikeskkonna muutusele viivitusega. Sinine riba esimesel tunnil ei tõenda ebaõnnestumist ning valge riba kuuendal tunnil kirjeldab riba seisundit kuuendal tunnil.
Samal põhjusel on oluline paigutus. Hoidke riba gaasiruumis, läbi kaane nähtavana ning eemal agari pindadest ja söötmetest. See näitab oma vahetu keskkonna seisundit. Kui asetate selle tihedalt vastu külma seina, peidate söötmeplaatide alla või lasete kondensaadil seda läbi leotada, näitab see anuma asemel selle mikrokeskkonna seisundit.
Mida riba näitab ja mida mitte
Käsitlege anaeroobse anuma metüleensinise indikaatorit ühe andurina ühes asukohas. See näitab kohalikke redoks- ja hapnikutingimusi oma reaktsioonipiirkonnas. Piisava segunemise ja tasakaalustumise korral esindavad need üldjoontes gaasiruumi tingimusi. Kõik sellest kaugemale ulatuv on järeldus ning järeldused vajavad eraldi tõendeid.
Värvitu riba ei tõenda steriilsust. Steriilsus tähendab eluvõimeliste organismide puudumist, mida tõendatakse valideeritud steriliseerimise ja kultiveerimise valideerimiskontrollidega. Anum võib olla täielikult anaeroobne ja siiski saastunud või täielikult steriilne ja siiski aeroobne.
See ei valideeri kultiveerimissüsteemi kõiki osi. Suletud katseklaasis lahustunud hapnik, sügavas agaris lõksu jäänud hapnik, tihedalt täidetud anuma gradiendid ja pärast näidu lugemist tekkiv leke jäävad ühe riba vaateväljast välja. Ruumiliste tingimuste katsetes täheldati samas anumas kõrvuti siniseid ja värvituid piirkondi, kus hapniku tungimine ja redutseeriv aktiivsus olid erinevas tasakaalus. Üks punkt ei saa kinnitada tingimusi kogu ruumalas.
See ei tõenda katkematut anaeroobioosi. Riba ühekordne lugemine katse alustamisel ei ütle midagi kahekümnenda tunni kohta. Hiljutised anaeroobsete tingimuste kvaliteedi uuringud hoiatavad, et keemilised indikaatorid kirjeldavad gaasikeskkonda lugemise hetkel ning võivad näida rahuldavad ka väikese jääkhapnikusisalduse korral. Riba näidu seob inkubeerimisega pidev dokumenteerimine või kontrollpunktides tehtud dokumenteerimine, mitte üks pilk lõpptulemusele.
Värvimuutuse keemilise tausta kohta lugege, kuidas metüleensinine liigub oksüdeerunud ja redutseerunud oleku vahel. Selle kohta, kuidas hapnik proovide käsitlemist laiemalt mõjutab, vaadake hapniku kontrollimist mikroskoopia- ja kultiveerimistöös.
Skeem anuma kõrval hoidmiseks
Allolev joonis koondab artikli üheks laborilaual kasutatavaks meelespeaks. Sellel on sama riba kolm olekut, reaktsiooni kaks suunda ning piir indikaatori antud tõendite ja süsteemi valideerimise vahel.
| Tähelepanek | Põhjendatud tõlgendus | Vajalik järgmine samm |
|---|---|---|
| Riba on pärast toote jaoks määratud aega sinine | Anaeroobioos riba juures on kinnitamata | Kontrollige tihendust, kotikese aktiveerimist ja suutlikkust, vajaduse korral katalüsaatorit ning riba niisutamist ja kõlblikkusaega; ärge kultuure veel tõlgendage |
| Riba kahvatub tundide jooksul ja jääb seejärel värvituks | Sel hetkel on riba juures saavutatud redutseerivad tingimused | Dokumenteerige aeg ja värvus; jätkake inkubeerimise ajal kontrollpunktides kontrollimist |
| Riba on enne avamist värvitu, pärast avamist sinine | Ootuspärane taasoksüdeerumine õhuga kokkupuutel | Kasutage lõpptulemusena avamiseelset näitu; ärge hinnake katset tagantjärele ebaõnnestunuks |
| Riba on värvitu, kuid katseklaas näib oksüdeerunud | Ainult kohalik näit | Hinnake katseklaasi selle enda tõendite põhjal; kontrollige gradiente, lahustunud hapnikku ja anuma täitmist |
| Riba mis tahes värvus koos kasvuga või kasvu puudumisega | Steriilsuse või eluvõimelisuse kohta ei saa järeldust teha | Kasutage eraldi steriilsuse ja eluvõimelisuse kontrolle |
Rikked, mis hoiavad riba sinisena või annavad eksliku kindlustunde
Enamik tõrkeid jaguneb viide rühma. Igal neist on oma iseloomulik tunnus.
Lekkiv anum või kott varustab reaktsioonipiirkonda pidevalt hapnikuga. Riba jääb siniseks või muutub pärast kahvatumist uuesti siniseks. Enne keemilise süsteemi süüdistamist kontrollige kaant, tihendit, klambreid ja tihenduspindu.
Ammendunud või valesti aktiveeritud gaasigeneraator ei eemalda hapnikku. Vanemates veega aktiveeritavates süsteemides olid varajased hoiatusmärgid kondensaadi puudumine umbes 10 kuni 15 minuti juures ja kaane soojenemise puudumine umbes 20 kuni 40 minuti juures. Ületäidetud anumas kasutatav liiga väikese suutlikkusega kotike ebaõnnestub samal viisil.
Katalüsaatori mürgistumine puudutab ainult vanemaid vesiniku ja pallaadiumiga süsteeme, kus pallaadium aitab vesinikul ja hapnikul veeks ühineda. Niiskus ja vesiniksulfiid halvendavad selle toimimist. Paljud tänapäevased kotikesed ei kasuta üldse pallaadiumi, seega ärge rakendage seda parandust seal, kus see ei ole asjakohane.
Kahjustunud või valesti käsitsetud riba võib märkamatult tõrkuda. Värvaine ja redutseerija kaotavad säilitamisel pöörduvuse. See on üks põhjus, miks töötati välja hübriidkoostised, mis taluvad paremini valgusest tingitud pleekimist ja säilitamisel tekkivat toimekadu. Kõrvaldage aegunud varud, ebatavalise algvärvusega varud ning ribad, mida on niisutatud, kuigi need peaksid olema kuivad, või jäetud kuivaks, kuigi need vajavad niisutamist.
Gradient või viivitus eksitab lugejat, mitte keemilist süsteemi. Halvasti segunenud gaasiruum, lahustunud hapnikuga suletud katseklaasid ja pooltahked söötmed säilitavad oma tingimusi kauem, kui riba põhjal võiks arvata. Resasuriiniribad muutuvad roosa vaheoleku kaudu värvituks ja neid turustatakse sageli kiirematena, kuid nende läviväärtused sõltuvad nende enda koostisest ega ole ülekantavad metüleensinisele.
Kontrollid ja lugemisprotokoll, mida tasub järgida
Kaks odavat kontrolli aitavad avastada enamiku väärtõlgendustest. Hoidke katse kõrval toaõhus värsket õhukontrolli riba. Töökorras metüleensinise riba püsib seal sinisena. Mõned pakendatud indikaatorid on algul kahvatud ja muutuvad avamisel siniseks, mis on iseenesest toimimise kontroll. Lisaks asetage aeg-ajalt värske riba varem valideeritud anaeroobsesse süsteemi. See peaks jõudma toote jaoks määratud aja jooksul valideeritud redutseerunud lõppolekusse. Kui kumbki kontroll ei toimi ootuspäraselt, asendage partii enne anuma näitude usaldamist.
Lugemisprotokoll tuleneb toimemehhanismist. Asetage riba gaasiruumi nii, et see oleks nähtav anumat avamata, ning järgige tootega kaasas olevat juhendit seinakontakti ja niisutamise kohta. Märkige üles algvärvus, anuma sulgemise aeg ja värvus toote jaoks määratud kontrollpunktis. Kui anum seda võimaldab, dokumenteerige inkubeerimise ajal määratud kontrollpunktides, et indikaator püsis redutseerunud olekus. Märkige lõppvärvus üles vahetult enne avamist. Selle katse lõpptulemus on avamiseelne värvus. Pärast avamist on uuesti siniseks muutumine ootuspärane; ärge laske sellel varasemat tulemust ümber kirjutada.
Kui riba jääb pärast määratud aega siniseks, käsitlege anaeroobioosi kinnitamata seisundina. Kontrollige järjest: tihendus, kotike, katalüsaator, kui see on olemas, indikaatori niisutamine ja kõlblikkusaeg ning seejärel indikaatori toimimine võrdluses õhukontrolliga. Alles pärast gaasikeskkonna kinnitamist võib kasvu või kasvu puudumist tõlgendada, kasutades rakendusele sobivat anaeroobset kultiveerimissüsteemi ja organismikontrolle.
Oma pädevusvaldkonnas väärib riba viimast sõna. Sinise või värvituna vastab see ühele küsimusele ühe koha kohta ühel ajahetkel. Esitage see küsimus ettenähtud ajal ja koos kõrval olevate kontrollidega ning vastus on usaldusväärne. Kui küsite ühe pilgu põhjal steriilsuse, iga katseklaasi või kogu inkubeerimise kohta, ei saa ükski indikaatori keemiline lahendus seda tõlgendust päästa.