Loeffleri aluselise ja polükroomse metüleensinise värvingute selgitus

Värvimislaual võib kõrvuti seista kolm pudelit, mille siltidel on metüleensinise eri variandid. Ühel on kirjas metüleensinise 1% vesilahus. Teisel Loeffleri aluseline metüleensinine. Kolmandal polükroomne metüleensinine. Kiirustav töötaja haarab kõige lähema pudeli. Äigepreparaat värvub seejärel liiga nõrgalt, liiga ühtlaselt siniseks või ootamatutes lillades toonides ning tulemuses süüdistatakse proovi.

Probleem on koostises, mitte proovis. Need kolm lahust sisaldavad omavahel seotud värvaineid, kuid põhinevad erinevatel värvimispõhimõtetel. Üks on lihtne katioonne värvaine peaaegu neutraalse pH juures. Teine on sama värvaine, mille toimet on leelisega tugevdatud. Kolmas ei ole enam üldse üksik värvaine, vaid tahtlikult oksüdeeritud segu. Vale lahuse kasutamisel muutub teie käes ka värvimispõhimõte.

Lühivastus

Tavaline metüleensinise vesilahus on lähtepunkt: ligikaudu 1% värvainet vees, lihtne katioonne värvaine bakterite morfoloogia uurimiseks ja üldiseks mikroskoopiaks. Loeffleri aluselise metüleensinise puhul lisatakse veega lahjendatud alkohoolsele põhilahusele väike mõõdetud kogus lahjat leelist. See tõstab pH-d ja soodustab katioonse värvaine tugevamat seondumist bakterite happeliste struktuuridega. Polükroomne metüleensinine on metüleensinine, mida on tahtlikult küpsetatud leeliselises keskkonnas oksüdeerimise teel. Seetõttu sisaldab pudel lisaks allesjäänud metüleensinisele demetüülitud homoloogide (azure A, azure B, azure C), tioniini ja metüleenvioleti segu ning see segu värvib eri struktuure eri toonides.

Kui jätate meelde vaid ühe lause: leelistamine muudab värvumise intensiivsust, polükroomseks muutmine aga värvitoone.

Tavaline metüleensinise vesilahus: võrdlusalus

Lihtsaim koostis on vees lahustatud metüleensinine, tavaliselt kontsentratsiooniga 1% w/v, ilma leelise ja oksüdeerimiseta. Värvust andev osake on metüültioniiniumkatioon koos kloriid-vastasioniga: väike lame fenotiasiinvärvaine, mida PubChemi metüleensinise kirjes kirjeldatakse metüültioniiniumkloriidina. Katioonina seondub see nukleiinhapete fosfaatkarkasside ja bakterite rakuseinte happeliste rühmadega, värvides rakud heledal taustal siniseks.

Selle eelis on ennustatavus. Tuumad ja bakterid paistavad sinistena. Kontrast on tagasihoidlik. Nõrgalt eristuvad mikroorganismid võivad värvuda nõrgalt ning just seda piirangut Loeffler kõrvaldada püüdiski. Selle lahuse laiema lihtsate bakterivärvingute rühma kohta leiate teavet bakterite lihtvärvimise ülevaatest. Ka siin on tähtis värvaine täpne identifitseerimine: metüülsinine on täiesti teine molekul, nagu selgitab artikkel metüülsinise ja metüleensinise erinevustest. Seega võib kataloogist üksnes värvinime järgi otsimine viia vale värvaineklassini.

Loeffleri aluseline metüleensinine: sama värvaine, tugevam toime

Klassikaline Loeffleri retsept ühendab metüleensinise alkohoolse põhilahuse lahja leelise vesilahusega. Õpikutes toodud variandid näevad ette 0.3 g värvainet 30 mL 95% etanoolis koos 100 mL 0.01% kaaliumhüdroksiidi vesilahusega (või samaväärselt 30 mL küllastunud alkohoolset metüleensinise lahust, 100 mL destilleeritud vett ja 1 mL 1% KOH lahust). Tulemuseks on ligikaudu 0.3% värvainesisaldusega selgelt aluselise pH-ga töölahus. Kaubanduslikud variandid järgivad sama põhimõtet ning Thermo Fisheri mikrobioloogiliste värvainete kataloogis on Loeffleri aluseline metüleensinine, polükroomne variant ja vesilahus loetletud eraldi kataloogitoodetena, millel on erinevad kasutusotstarbed.

Põhiline on leelise toime. pH tõstmine deprotoneerib proovi karboksüül- ja fosfaatrühmad, suurendades negatiivselt laetud seondumiskohtade tihedust. Alkohoolne põhilahus hoiab värvaine täielikult lahustununa, nii et see jõuab nende kohtadeni monomeersel kujul. Tulemuseks on bakterite kiirem ja intensiivsem värvumine kui neutraalse vesilahusega ning tavapärasele bakterioloogilisele äigepreparaadile iseloomulikud sügavsinised pulkbakterid ja kokid. Värvimisaeg on tavaliselt üks kuni kolm minutit, millele järgneb veega loputamine.

Klassikaline kasutusala on Loeffleri seerumsöötmel kasvatatud Corynebacterium diphtheriae: peened, sageli nuiakujulised pulkbakterid, mille talletatud polüfosfaati sisaldavad metakromaatilised Babesi-Ernsti graanulid värvuvad tugevalt. Söötme ja värvaine seos on ajalooline: mõlemad omistatakse samale bakterioloogile ning graanulite kontrast annab diagnostilise eelise. Lisaks difteeriaga seotud töödele kasutatakse seda üldise bakterioloogilise värvainena kultuuridest valmistatud äigepreparaatides, Neisseria morfoloogia uurimiseks kliinilistes äigepreparaatides ja kõikjal, kus Grami värving pole vajalik, kuid tavaline sinine vesilahus jääb liiga nõrgaks. Tegemist on ühevärvilise värvinguga. Kõik happelised struktuurid omandavad mõne sinise tooni. Kui protokoll nõuab värvuste abil eristamist, ei saa leelis üksi seda tagada.

Üks praktiline hoiatus: aluselised värvainelahused riknevad ja sadestuvad säilitamisel ning süsinikdioksiidi neeldumisel. Laborid valmistavad kas väikesi koguseid või ostavad kataloogilahuse ja järgivad selle säilivusaega, selle asemel et hoida kasutuses vana pudelit, millest satub nüüd igale alusklaasile sadet.

Polükroomne metüleensinine: üks nimi, mitu värvainet

Polükroomse metüleensinise lähteaine on sama värvaine, kuid seda oksüdeeritakse kontrollitult leeliselises keskkonnas. Ajalooliselt nimetati seda küpsetamiseks või polükroomseks muutmiseks. Leeliseline vanandamine, karbonaadiga kuumutamine või oksüdeerimine selliste ainetega nagu dikromaat eemaldab dimetüülaminoasendajatelt järk-järgult metüülrühmi. Tulemuseks on segu: allesjäänud metüleensinine koos azure B-ga (üks metüülrühm eemaldatud), azure A ja azure C-ga (edasine demetüülimine), tioniiniga (täielikult demetüülitud) ning metüleenvioleti rühma oksüdatiivsete kõrvalproduktidega. Igal komponendil on oma värvitoon ja afiinsus kudede suhtes, mistõttu segu värvib metakromaatiliselt: tuumad, graanulid, mutsiinid ja kõhr omandavad erinevaid toone sinisest punakaslillani.

Sama keemia on ka tuntud verevärvingute aluseks. Varased uurijad leidsid, et leelistatud metüleensinine värvis malaariaparasiitide tuumad lilladesse toonidesse, kuid nende küpsetatud vesilahused olid ebastabiilsed ja sadestusid mõne päevaga. Ülevaade lilla verevärvingu leiutamisest kirjeldab, kuidas Malachowski ja Romanowsky kasutasid seda efekti teineteisest sõltumatult 1891. aastal, kuidas võeti kasutusele metanool värvaine sademe stabiliseerimiseks ja äigepreparaatide fikseerimiseks ilma kuumutamiseta ning kuidas Giemsa hiljem standardiseeris segu, kasutades mõõdetud koguseid azure B-d ja eosiini ning stabiliseerimiseks glütserooli. Tänapäevased Giemsa-tüüpi värvained pärinevad otseselt polükroomse metüleensinise ja eosiini segust, mis tekitab Romanowsky efekti. Eosiiniga kombineerimist ja azure B komponendi rolli käsitleb üksikasjalikult artikkel Romanowsky-tüüpi värvingutest ning azure B ja eosiini koostoimest.

Kuna polükroomne metüleensinine on segu, on see olemuselt neist kolmest kõige vähem standardiseeritud. Selle täpne värvitoonide tasakaal sõltub oksüdeerimisviisist ja -ulatusest. Seetõttu müüvad histoloogiatarvikute tarnijad seda eraldi tootena, mille toimivust eraldi kontrollitakse, mitte vanandatud Loeffleri lahusena. Tüüpilised kasutusalad on nuumrakkude graanulite, mutsiinide ja kõhre metakromaatiline esiletoomine, plasmarakkude detailide uurimine ning Helicobacter pylori tuvastamine koelõikudes Goodpasture'i-tüüpi polükroomsete meetoditega. See on õige valik siis, kui eesmärk on värvuste abil eristamine, ja vale valik siis, kui protokoll eeldab selget ühevärvilist bakterikontuuri.

Koostise ja kasutusotstarbe võrdlus

Kasutage tabelit otsustusjuhisena. Kui proov värvub liiga nõrgalt, muutke pH-põhimõtet ja valige Loeffleri lahus. Kui kõik värvub, kuid miski ei eristu, muutke värvainepõhimõtet ja valige polükroomne lahus. Kui Loeffleri lahusega värvitud äigepreparaadis paistavad graanulid suurepäraselt, kuid juhendaja küsib, miks tuumad ja tsütoplasma on ühtviisi sinised, on vastus selles, et ükski aluseline ühevärviline värvaine ei suuda neid värvuse järgi eristada. See ülesanne kuulub polükroomsete värvainete rühmale ja sellest pärinevatele verevärvainetele.

Levinud segiajamiste vältimine

Suurem osa segadusest tuleneb kahest veast. Esimene on Loeffleri lahuse pidamine tavalise metüleensinisega asendatavaks, sest mõlemad paistavad pudelis sinised. Need erinevad pH ja värvimisintensiivsuse poolest ning neutraalse värvaine kasutamine ettenähtud Loeffleri lahuse asemel kaotab just selle graanulite kontrasti, mille saavutamiseks protokoll koostati. Teine viga on mis tahes vana või juhuslikult vananenud aluselise sinise lahuse pidamine polükroomseks. Kontrollimatu vananemine tekitab tundmatu koostise ja kontsentratsiooniga segu, samas kui tõelised polükroomsed lahused valmistatakse kindlaksmääratud oksüdeerimisviisidega ning verevärvainete puhul kombineeritakse mõõdetud koguse eosiiniga. Ajalugu on siin õpetlik: 1890. aastate ebastabiilsed küpsetatud vesilahused asendusid metanooliga stabiliseeritud lahustega just seetõttu, et kontrollimatuid segusid ei saanud reprodutseerida. Seda õppetundi tasub meenutada enne diagnostilise preparaadi värvimist teadmata vanusega pudelist.

Täpsus nimetustes viib asja lõpule. Kontrollige sildilt kataloogitoodet (vesilahus, Loeffleri lahus või polükroomne lahus), värvainesisaldust ja ettenähtud kasutusotstarvet, selle asemel et neid värvuse järgi oletada. Neil kolmel koostisel on ühine kromofoorne lähteaine. Nende kasutusotstarve ei ole ühine.