Σημαίνει η μεγαλύτερη κατανάλωση οξυγόνου περισσότερο ATP; Διδάγματα από μελέτες για το κυανό του μεθυλενίου

Ένα απομονωμένο μιτοχόνδριο βρίσκεται σε έναν θάλαμο με καύσιμο αλλά χωρίς ADP. Καταναλώνει οξυγόνο αργά. Προσθέστε ADP και η κατανάλωση οξυγόνου αυξάνεται πολλαπλάσια. Περιμένετε μέχρι να εξαντληθεί το ADP και η κατανάλωση οξυγόνου μειώνεται ξανά. Το καύσιμο δεν άλλαξε ποτέ. Άλλαξε μόνο η ζήτηση για ATP.

Αυτή η σύντομη αλληλουχία περιέχει ολόκληρη τη διάκριση που εξετάζει το άρθρο. Η κατανάλωση οξυγόνου μετρά πόσο γρήγορα ρέουν τα ηλεκτρόνια μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας προς το οξυγόνο. Η παραγωγή ATP μετρά πόσο από αυτή τη ροή αποθηκεύεται ως αξιοποιήσιμη ενέργεια. Τα δύο μοιράζονται ένα ενδιάμεσο βήμα, τη βαθμίδα πρωτονίων εκατέρωθεν της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης. Οτιδήποτε αλλάζει τον βαθμό σύζευξης αυτής της βαθμίδας με τη σύνθεση ATP μπορεί να μεταβάλει τα δύο τελικά μεγέθη προς διαφορετικές κατευθύνσεις. Το κυανό του μεθυλενίου αποτελεί χρήσιμο διδακτικό παράδειγμα, επειδή έχει παρατηρηθεί να κάνει και τα δύο: να αυξάνει τη χρήση οξυγόνου μαζί με το ATP σε ορισμένα παρασκευάσματα και να αυξάνει τη χρήση οξυγόνου ενώ το ATP παραμένει σταθερό ή μειώνεται σε άλλα.

Οι αναγνώστες που θέλουν πρώτα μια ευρύτερη εικόνα της μεταφοράς ηλεκτρονίων μπορούν να ξεκινήσουν από το πώς το κυανό του μεθυλενίου μεταφέρει ηλεκτρόνια μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας. Όσοι θέλουν να εξοικειωθούν με την ορολογία των πρώτων πειραμάτων με οξυγόνο μπορούν να διαβάσουν τι έδειξαν πραγματικά οι πρώτες μετρήσεις αναπνοής.

Η αναπνοή, το ATP και η βαθμίδα ανάμεσά τους

Τα ηλεκτρόνια από το NADH και το FADH2 εισέρχονται στην αλυσίδα στα σύμπλοκα I και II, περνούν μέσω του συμπλόκου III στο κυτόχρωμα c και έπειτα μέσω του συμπλόκου IV στο οξυγόνο. Η ενέργεια που απελευθερώνεται στα σύμπλοκα I, III και IV αντλεί πρωτόνια από τη μιτοχονδριακή μήτρα προς τον διαμεμβρανικό χώρο. Αυτός ο διαχωρισμός φορτίου και οξύτητας αποτελεί την πρωτονιοκινητική δύναμη, και η ηλεκτρική της συνιστώσα, το μεμβρανικό δυναμικό, είναι συνήθως η κυρίαρχη.

Η συνθάση του ATP επιτρέπει στα πρωτόνια να επιστρέψουν στη μήτρα και χρησιμοποιεί την ενέργεια που απελευθερώνεται για να συνενώσει το ADP με φωσφορικό και να σχηματίσει ATP. Επομένως, η αλληλουχία είναι:

κατανάλωση οξυγόνου, έπειτα άντληση πρωτονίων, έπειτα βαθμίδα, έπειτα σύνθεση ATP.

Το πρόβλημα είναι ότι τα πρωτόνια μπορούν να επιστρέψουν και από άλλες οδούς. Κάθε επιστροφή που παρακάμπτει τη συνθάση του ATP αποτελεί διαρροή πρωτονίων. Η διαρροή αναγκάζει την αλυσίδα να αντλεί ξανά τα ίδια πρωτόνια για να διατηρεί σταθερό το μεμβρανικό δυναμικό, καταναλώνοντας περισσότερο οξυγόνο χωρίς να παράγει περισσότερο ATP. Μια αρκετά ισχυρή διαρροή αποτελεί αποσύζευξη: η χρήση οξυγόνου αυξάνεται ενώ το ATP παραμένει σταθερό ή μειώνεται, και η ενέργεια που χάνεται αποβάλλεται ως θερμότητα.

Η κατάσταση 3, η κατάσταση 4 και ο λόγος αναπνευστικού ελέγχου

Η κλασική ορολογία προέρχεται από τα απομονωμένα μιτοχόνδρια. Η κατάσταση 3 είναι η αναπνοή παρουσία υποστρώματος και ADP: η συνθάση του ATP μειώνει τη βαθμίδα, το μεμβρανικό δυναμικό πέφτει, η αλυσίδα επιταχύνεται για να το αποκαταστήσει και η χρήση οξυγόνου είναι υψηλή επειδή παράγεται ATP. Η κατάσταση 4 είναι η αναπνοή μετά την εξάντληση του ADP: η συνθάση του ATP αδρανεί, η βαθμίδα αυξάνεται, το υψηλό μεμβρανικό δυναμικό αντιστέκεται στην περαιτέρω άντληση και η χρήση οξυγόνου μειώνεται στο επίπεδο που απαιτείται για την αντιστάθμιση της διαρροής.

Ο λόγος αναπνευστικού ελέγχου, δηλαδή η κατάσταση 3 διαιρεμένη με την κατάσταση 4, δείχνει επομένως πόσο στενά συζευγμένο είναι το παρασκεύασμα. Ένας υψηλός λόγος σημαίνει ότι το ADP ελέγχει ισχυρά την αναπνοή. Ένας λόγος που μειώνεται ενώ αυξάνεται η αναπνοή στην κατάσταση 4 σημαίνει ότι η διαρροή αρχίζει να κυριαρχεί. Μέσα από αυτό το πρίσμα γίνονται κατανοητά τα παρακάτω αποτελέσματα για το κυανό του μεθυλενίου.

Αξίζει να κρατήσουμε ένα νοητικό μοντέλο. Το υψηλό μεμβρανικό δυναμικό επιβραδύνει την αλυσίδα. Η εξασθένηση του δυναμικού την επιταχύνει. Η αλυσίδα ανταποκρίνεται στο πόσο δύσκολη έχει γίνει η άντληση, όχι άμεσα στο αν παράγεται ATP.

Όταν τα τελικά μεγέθη μεταβάλλονται μαζί

Το σαφέστερο παράδειγμα σύζευξης προέρχεται από απομονωμένα μιτοχόνδρια εγκεφάλου ινδικού χοιριδίου με ανασταλμένα αναπνευστικά σύμπλοκα. Σε συγκεντρώσεις κυανού του μεθυλενίου από 100 nanomolar έως 1 micromolar, η κατανάλωση οξυγόνου σε ηρεμία αυξήθηκε με γλουταμικό μαζί με μηλικό, με ηλεκτρικό ή με γλυκεροφωσφορικό ως καύσιμο, ενώ η αναπνοή που διεγείρεται από το ADP παρέμεινε αμετάβλητη. Σε μιτοχόνδρια με τοξική αναστολή στο σύμπλοκο I ή στο σύμπλοκο III, η χρωστική αύξησε σε μικρό βαθμό την παραγωγή ATP, αποκατέστησε το μεμβρανικό δυναμικό και βελτίωσε την πρόσληψη ασβεστίου. Η προτεινόμενη οδός είναι μια παράκαμψη: η χρωστική δέχεται ηλεκτρόνια πριν από το σημείο αναστολής και τα παραδίδει στο κυτόχρωμα c, παρακάμπτοντας το σύμπλοκο που έχει υποστεί βλάβη.

Μια δεύτερη περίπτωση συνδυασμένης μεταβολής χρησιμοποιεί μια εντελώς διαφορετική πηγή ATP. Σε απομονωμένα μιτοχόνδρια εγκεφάλου με ανασταλμένη συνθάση του ATP, το κυανό του μεθυλενίου εξακολουθούσε να διεγείρει την αναπνοή με κάθε υπόστρωμα που δοκιμάστηκε. Όμως η σύνθεση ATP αυξήθηκε μόνο με α-κετογλουταρικό και γλουταμικό, τα δύο υποστρώματα που σχηματίζουν σουκινυλο-CoA. Με την ολιγομυκίνη να αναστέλλει τη συνθάση του ATP, το επιπλέον ATP προερχόταν από φωσφορυλίωση σε επίπεδο υποστρώματος μέσω της λιγάσης του σουκινυλο-CoA στον κύκλο του κιτρικού οξέος, όχι από οξειδωτική φωσφορυλίωση. Η χρωστική αποκατέστησε επίσης το μεμβρανικό δυναμικό όταν το σύμπλοκο I και η συνθάση του ATP αναστέλλονταν ταυτόχρονα. Εδώ η χρήση οξυγόνου και το ATP μεταβλήθηκαν μαζί, αλλά μόνο όπου το υπόστρωμα επέτρεπε τη δεύτερη οδό παραγωγής ATP. Με ηλεκτρικό ή μηλικό, η αναπνοή αυξήθηκε χωρίς επιπλέον ATP. Ίδια χρωστική, ίδιος θάλαμος, διαφορετικό καύσιμο, διαφορετική απάντηση.

Όταν τα τελικά μεγέθη αποκλίνουν

Οι περιπτώσεις απόκλισης είναι εξίσου δημοσιευμένες και εξίσου διδακτικές. Σε μια μελέτη του 1997 με απομονωμένα μιτοχόνδρια ήπατος αρουραίου, το κυανό του μεθυλενίου επιτάχυνε την αναπνοή στην κατάσταση 4 σε στενά συζευγμένα μιτοχόνδρια που χρησιμοποιούσαν ηλεκτρικό, μειώνοντας έτσι τον λόγο αναπνευστικού ελέγχου. Η επίδραση ήταν ορατή από τα 0.5 micromolar και έντονη στα 5 micromolar, συγκέντρωση κοντά στα επίπεδα πλάσματος μετά από εφάπαξ ενδοφλέβια χορήγηση 100 milligram. Στα 5 micromolar τα μιτοχόνδρια διογκώθηκαν επίσης, αν και η διαταραχή της σύζευξης εμφανίστηκε πρώτα σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Αυτό υποστηρίζει ότι η διαρροή προηγήθηκε της δομικής βλάβης και δεν προήλθε από αυτήν. Σε αποσυζευγμένα μιτοχόνδρια, η χρωστική διέγειρε την αναπνοή με τρόπο που εξαρτιόταν από τη συγκέντρωση και παρουσίαζε κορεσμό. Η χρήση οξυγόνου αυξήθηκε και στα δύο παρασκευάσματα. Η σύνθεση ATP ανά ποσότητα οξυγόνου που καταναλώθηκε δεν αυξήθηκε. Πρόκειται για ένα κλασικό παράδειγμα αποσύζευξης μαζί με μεταφορά ηλεκτρονίων, στο ίδιο μόριο.

Η πιο εντυπωσιακή απόκλιση προέρχεται από τον αμφιβληστροειδή. Σε ποντίκια με ανεπάρκεια AIF και κύτταρα φωτοϋποδοχέων που εκτέθηκαν σε ροτενόνη, το κυανό του μεθυλενίου διατήρησε το πάχος του αμφιβληστροειδούς, τους δείκτες φωτοϋποδοχέων και τη μιτοχονδριακή δομή, ενώ μείωσε τον λόγο NADH προς NAD και περιόρισε οδούς απόκρισης στο στρες, μεταξύ των οποίων την απόκριση σε μη αναδιπλωμένες πρωτεΐνες και τη μιτοφαγία. Το έκανε χωρίς να διορθώσει το έλλειμμα ATP. Η προστασία χωρίς αποκατάσταση της ενέργειας σημαίνει ότι το όφελος προήλθε από την οξειδοαναγωγική ισορροπία και τη μιτοχονδριακή ακεραιότητα, όχι από επιπλέον ATP. Όποιος εξίσωνε την επιβίωση του ιστού με την αποκατάσταση της ενεργειακής παραγωγής θα παρερμήνευε πλήρως εκείνο το πείραμα.

Η εργασία με τα μιτοχόνδρια εγκεφάλου προσθέτει και μια στήλη κόστους στον ίδιο απολογισμό. Οι ίδιες χαμηλές συγκεντρώσεις που βελτίωσαν τη βιοενεργειακή αύξησαν επίσης την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου σε κάθε συνθήκη που δοκιμάστηκε και επιβράδυναν την απομάκρυνσή του. Η μέτρηση έγινε με βαθμονομημένη δοκιμασία Amplex και όχι με μη ειδική χρωστική. Περισσότερο ATP και περισσότερος οξειδωτικός παράγοντας εμφανίστηκαν μαζί.

Ένας πρακτικός κατάλογος ελέγχου για την ανάγνωση

Τέσσερα ερωτήματα διαχωρίζουν ένα συζευγμένο αποτέλεσμα από ένα αποσυζευγμένο.

Πρώτον, ποιο τελικό μέγεθος μετρήθηκε πραγματικά. Η κατανάλωση οξυγόνου από μόνη της δεν μπορεί να δώσει πληροφορίες για το ATP. Η σύνθεση ATP, το μεμβρανικό δυναμικό και ο λόγος αναπνευστικού ελέγχου προσθέτουν το καθένα ένα στοιχείο που το ηλεκτρόδιο οξυγόνου δεν μπορεί να ανιχνεύσει. Ο οδηγός για την ανάγνωση ερευνητικών ισχυρισμών σχετικά με το κυανό του μεθυλενίου εξετάζει αναλυτικά αυτή την προσεκτική διάκριση των τελικών μεγεθών.

Δεύτερον, ποιο υπόστρωμα τροφοδοτούσε τα μιτοχόνδρια. Το αποτέλεσμα με το σουκινυλο-CoA δείχνει ότι η επιλογή καυσίμου μπορεί να καθορίσει αν η επιπλέον αναπνοή μπορεί καν να μετατραπεί σε επιπλέον ATP.

Τρίτον, ποια συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε. Το κυανό του μεθυλενίου σε συγκεντρώσεις από την περιοχή των nanomolar έως τη χαμηλή περιοχή των micromolar σε μιτοχόνδρια εγκεφάλου έδωσε μικρά βιοενεργειακά οφέλη με οξειδωτικό κόστος· από 0.5 micromolar και πάνω σε μιτοχόνδρια ήπατος υπονόμευσε τη σύζευξη· στα 5 micromolar προστέθηκε και διόγκωση. Η συγκέντρωση αποτελεί μέρος του μηχανισμού, όχι δευτερεύουσα λεπτομέρεια.

Τέταρτον, σε ποιο μοντέλο προέκυψε το αποτέλεσμα. Τα απομονωμένα μιτοχόνδρια αποκαλύπτουν τη συνδεσμολογία, αλλά τα ακέραια κύτταρα και οι ιστοί προσθέτουν τη μεταφορά, την αναγωγή στην άχρωμη μορφή και ανταγωνιστικούς αποδέκτες ηλεκτρονίων. Η εργαστηριακή έρευνα για τη δοσολογία, συμπεριλαμβανομένου του τρόπου με τον οποίο η συγκέντρωση και το πρωτόκολλο διαμορφώνουν τις επιδράσεις του κυανού του μεθυλενίου, αποτελεί τη γέφυρα ανάμεσα στις μετρήσεις του θαλάμου και σε οποιονδήποτε ισχυρισμό για έναν άνθρωπο.

Η κατανάλωση οξυγόνου δείχνει τη ροή ηλεκτρονίων. Το ATP δείχνει πόσο από αυτή τη ροή αποθηκεύτηκε. Το κυανό του μεθυλενίου μπορεί να μεταβάλει οποιοδήποτε από τα δύο, και τα παραπάνω πειράματα δείχνουν και τους τέσσερις συνδυασμούς που προκύπτουν: αυξάνονται και τα δύο, η αναπνοή αυξάνεται μόνο όπου το επιτρέπει το υπόστρωμα, η αναπνοή αυξάνεται ενώ η σύζευξη μειώνεται, και ο ιστός διατηρείται ενώ το ATP παραμένει σταθερό. Η ένδειξη στο ηλεκτρόδιο οξυγόνου είναι η αρχή της ερμηνείας, όχι το τέλος της.