Φάσμα απορρόφησης του κυανού του μεθυλενίου και μοριακός συντελεστής απορρόφησης: αναφορά με καταγεγραμμένες συνθήκες

Ένα φάσμα κυανού του μεθυλενίου φαίνεται απλό μέχρι να επιχειρήσετε να επαναχρησιμοποιήσετε μια αριθμητική τιμή του. Ένα εργαστήριο αναφέρει μοριακό συντελεστή απόσβεσης κοντά στις 82,000. Ένα άλλο αναφέρει 67,000. Ένα τρίτο αναφέρει πάνω από 100,000. Και οι τρεις τιμές μπορούν να περιγράφουν σωστά τις αντίστοιχες μετρήσεις, αλλά καμία δεν αποτελεί καθολική σταθερά για τη χρωστική.

Η σύγχυση προκύπτει από την ανάμειξη δύο διαφορετικών εννοιών. Η απορρόφηση είναι μέτρηση που πραγματοποιείται σε συγκεκριμένο διάλυμα μέσα σε συγκεκριμένη κυψελίδα. Ο μοριακός συντελεστής απορρόφησης, που συχνά γράφεται ως epsilon, είναι παράμετρος ενός μοντέλου αυτού του διαλύματος. Όταν αλλάζει η κατάσταση συσσωμάτωσης του κυανού του μεθυλενίου, αλλάζει το μοντέλο και, επομένως, αλλάζει και η παράμετρος. Η χρήσιμη πρακτική είναι να αντιμετωπίζετε κάθε συντελεστή ως τιμή με καταγεγραμμένες συνθήκες: το μήκος κύματος, ο διαλύτης, το pH ή το ρυθμιστικό διάλυμα, η θερμοκρασία, το εύρος συγκέντρωσης και το μήκος οπτικής διαδρομής συνοδεύουν τον αριθμό.

Η ζώνη του μονομερούς σε αραιό υδατικό διάλυμα

Σε αραιό υδατικό διάλυμα, η κυρίαρχη ζώνη του κατιόντος του κυανού του μεθυλενίου βρίσκεται κοντά στα 664 έως 665 nm, με τις συνήθως αναφερόμενες τιμές να κυμαίνονται από 664 έως 668 nm ανάλογα με το όργανο και τις επιλογές βαθμονόμησης. Αυτή η ζώνη είναι η κατάλληλη επιλογή για ποσοτικό προσδιορισμό όταν το διάλυμα είναι αρκετά αραιό ώστε το μεγαλύτερο μέρος της χρωστικής να βρίσκεται σε μονομερή μορφή.

Τρεις τιμές από τη βιβλιογραφία δείχνουν γιατί οι συνθήκες έχουν μεγαλύτερη σημασία από τον αριθμό που προβάλλεται. Ερευνητές αργίλων που διατήρησαν τα υδατικά δείγματα κάτω από περίπου 7 micromolar σε κυψελίδες 1 cm ανέφεραν epsilon περίπου 82,000 M-1 cm-1 στα 665 nm. Αυτή η τιμή είναι ασυνήθιστα καλά τεκμηριωμένη ως εμπειρική κλίση βαθμονόμησης για πολύ αραιά υδατικά δείγματα. Μια μεταγενέστερη πρωτογενής βαθμονόμηση σε απιονισμένο νερό, με συγκεντρώσεις 2.34 έως 37.52 micromolar και οπτική διαδρομή 1 cm, έδωσε περίπου 67,100 M-1 cm-1 στα 665 nm για τη συνολική χρωστική. Το χαμηλότερο αποτέλεσμα είναι αναμενόμενο, όχι αντιφατικό, επειδή το ανώτερο μισό αυτού του εύρους βαθμονόμησης περιέχει ήδη σημαντική ποσότητα διμερούς. Μια τρίτη τιμή, περίπου 73,460 M-1 cm-1 στα 664 nm, προέρχεται από εργασία σε pH 6.86 και 293 K, στην οποία το παρατηρούμενο φάσμα αναλύθηκε σε συνιστώσες μονομερούς και διμερούς, όπως συνοψίζεται σε μια πρόσφατη κριτική ανασκόπηση της φωτοφυσικής του κυανού του μεθυλενίου. Αυτός ο αριθμός αφορά τη συνιστώσα του μονομερούς που προέκυψε με αποσυνέλιξη, όχι την άμεση κλίση της απορρόφησης ως προς τη συνολική χρωστική.

Το πρακτικό συμπέρασμα: επιλέξτε τον συντελεστή του οποίου οι συνθήκες ταιριάζουν με τα δείγματά σας ή πραγματοποιήστε δική σας βαθμονόμηση. Μη χρησιμοποιείτε την τιμή 82,000 σε έναν προσδιορισμό με συγκέντρωση 30 micromolar σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα θεωρώντας ότι η γραμμικότητα εξακολουθεί να ισχύει.

Ο ώμος στα μικρότερα μήκη κύματος είναι μείγμα συνεισφορών

Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση, ένας ώμος κοντά στα 600 έως 615 nm ενισχύεται σε σχέση με την κορυφή στα 664 nm. Οι σύγχρονες εργασίες τοποθετούν συνήθως τη συνεισφορά του διμερούς τύπου H κοντά στα 605 έως 610 nm. Η συνολική φασματική ανάλυση του κυανού του μεθυλενίου σε νερό διαχωρίζει ένα μέγιστο διμερούς στα 607 nm και ένα μέγιστο ανώτερου συσσωματώματος στα 600 nm, με συνιστώσες συντονισμού του μονομερούς στα 664 και 650 nm. Το πλήρες κείμενό της είναι διαθέσιμο μέσω της καταχώρισης ανοικτής πρόσβασης για το PMID 33251415.

Αυτός ο ώμος δεν πρέπει να χαρακτηρίζεται ως απορρόφηση αποκλειστικά του διμερούς. Η δονητικοηλεκτρονική δομή του μονομερούς συνεισφέρει επίσης στην ίδια περιοχή, οπότε το μετρούμενο ύψος προκύπτει από υπέρθεση. Μια συνολική προσαρμογή έδειξε ότι ένα μοντέλο μονομερούς και διμερούς δεν επαρκούσε για ολόκληρο το εύρος από 1.1 micromolar έως 3.4 millimolar, ενώ η προσθήκη τετραμερούς έδωσε την καλύτερη προσαρμογή, με το σήμα του τετραμερούς να είναι ήδη ανιχνεύσιμο κάτω από 34 micromolar. Οι εντάσεις των συνιστωσών που προέκυψαν από την προσαρμογή ήταν μεγάλες: περίπου 107,800 M-1 cm-1 στα 664 nm για την κύρια συνιστώσα του μονομερούς, περίπου 101,400 για το διμερές στα 607 nm και περίπου 138,500 για το τετραμερές στα 600 nm, σε απιονισμένο νερό χωρίς ρυθμιστικό διάλυμα, με χλωριούχο νάτριο από 0 έως 0.15 M και θερμοκρασίες από 282 έως 333 K. Πρόκειται για συνιστώσες που διαχωρίστηκαν μέσω μοντέλου, επομένως δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται αντί μιας εμπειρικής κλίσης Beer Lambert.

Η ισχύς του διμερισμού έχει ποσοτικοποιηθεί άμεσα. Σε pH 6.86 και 293 K, μια μελέτη προσδιόρισε σταθερά διμερισμού κοντά στις 3,900 M-1. Αυτό το μέγεθος εξηγεί γιατί ένα διάλυμα εργασίας 5 micromolar συμπεριφέρεται σχεδόν γραμμικά, ενώ ένα μητρικό διάλυμα 50 micromolar όχι. Ένας χρήσιμος έλεγχος κατά την ανάπτυξη μεθόδου είναι ο λόγος της απορρόφησης κοντά στα 610 nm προς την απορρόφηση κοντά στα 665 nm. Όταν αυτός ο λόγος αυξάνεται με τη συγκέντρωση, το epsilon στα 664 nm δεν περιγράφει πλέον ένα αμετάβλητο χημικό είδος.

Σε ένα διάστημα συγκεντρώσεων όπου κυριαρχεί ένα ζεύγος αλληλομετατρεπόμενων ειδών, τα φάσματα μπορούν να έχουν κοινό ισοσβεστικό σημείο, το οποίο παρατηρείται πειραματικά κοντά στα 625 nm σε υδατικές σειρές. Ένα σαφές, σταθερό σημείο είναι συμβατό με την παρουσία δύο κυρίαρχων ειδών. Όταν το σημείο μετατοπίζεται ή εξαφανίζεται καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση, αντιμετωπίστε το ως προειδοποίηση ότι έχουν εμφανιστεί ανώτερα συσσωματώματα ή μεταβαλλόμενες ισορροπίες, όχι ως σφάλμα του οργάνου.

Ο διαλύτης, το pH και η θερμοκρασία μετατοπίζουν το φάσμα

Το νερό ευνοεί τη συσσωμάτωση. Η προσθήκη διμεθυλοσουλφοξειδίου καταστέλλει τον διμερισμό, μετατοπίζει τα μέγιστα απορρόφησης και φθορισμού προς μεγαλύτερα μήκη κύματος και αυξάνει την κβαντική απόδοση φθορισμού περίπου κατά τέσσερις φορές, σύμφωνα με τη μελέτη της επίδρασης του διαλύτη στο κυανό του μεθυλενίου σε μείγματα νερού και DMSO, η οποία έχει καταχωριστεί ως PMID 30933781. Αυτή η εργασία αντιμετωπίζει τα υδατικά φάσματα ως ισορροπία μονομερούς και διμερούς, με απορρόφηση του μονομερούς κοντά στα 650 έως 670 nm και του διμερούς κοντά στα 580 έως 615 nm, και υπολογίζει σταθερές διμερισμού από τα φάσματα στους 293.15 K.

Οι αλκοόλες μετατοπίζουν τόσο τη θέση όσο και τη φαινόμενη ένταση, αλλά δεν εξαλείφουν τη συσσωμάτωση. Σε μια πρωτογενή σύγκριση στα 31.3 micromolar και σε θερμοκρασία δωματίου, η οποία αναφέρεται σε μελέτη της επίδρασης του διαλύτη στο κυανό του μεθυλενίου, το μέγιστο στα μεγαλύτερα μήκη κύματος ήταν στα 665 nm στο νερό αλλά στα 655 nm στη μεθανόλη, με φαινόμενες τιμές για το συνολικό διάλυμα κοντά στις 37,100 στο νερό και στις 60,800 στη μεθανόλη. Μια ξεχωριστή επικύρωση σε απόλυτη αιθανόλη στους 298 K έδωσε μέγιστο στα 655 nm με epsilon κοντά στις 68,000.

Οι συνήθεις μεταβολές του pH μετατοπίζουν το φάσμα λιγότερο από όσο υποθέτουν πολλά πρωτόκολλα. Η κριτική ανασκόπηση που αναφέρθηκε παραπάνω επισημαίνει ότι, από περίπου pH 2 έως pH 12, το μέγιστο παρέμεινε κοντά στα 665 nm, με μικρές μόνο μεταβολές έντασης έως το pH 11. Η ταυτότητα του ρυθμιστικού διαλύματος και η ιοντική ισχύς μπορούν να επηρεάσουν τα αποτελέσματα όσο και το ονομαστικό pH, επομένως καταγράψτε το συγκεκριμένο ρυθμιστικό διάλυμα και το άλας, όχι μόνο την ένδειξη του πεχαμέτρου. Ένα ισχυρό οξύ ή μια ισχυρή αλκάλη αποτελεί ξεχωριστή περίπτωση, επειδή η χρωστική μπορεί να υποστεί χημική μεταβολή αντί για αναστρέψιμη συσσωμάτωση. Η θερμοκρασία και το άλας μετατοπίζουν επίσης την ισορροπία, γι’ αυτό η μελέτη του 2020 σε νερό μετέβαλε σκόπιμα και τα δύο.

Μετρήσεις που διατηρούν την εγκυρότητα της τιμής

Η ποσοτική εργασία στηρίζεται στη σχέση Beer Lambert, σύμφωνα με την οποία η απορρόφηση ισούται με το epsilon επί τη συγκέντρωση επί το μήκος οπτικής διαδρομής, καθώς και στην απόδειξη ότι το γραμμικό διάστημα ισχύει πράγματι υπό τις συνθήκες σας.

Χρησιμοποιήστε κυψελίδα 1 cm για εργασία σε χαμηλές συγκεντρώσεις της τάξης των micromolar. Με epsilon κοντά στις 82,000, τα 5 micromolar δίνουν απορρόφηση κοντά στο 0.41 και τα 10 micromolar δίνουν περίπου 0.82. Για μέτρηση που εστιάζει στο μονομερές σε σκέτο νερό, είναι ασφαλέστερο να παραμένετε κοντά ή κάτω από περίπου 5 έως 7 micromolar παρά να επεκτείνετε τη βαθμονόμηση πολύ μέσα στην περιοχή των δεκάδων micromolar. Για πυκνά μητρικά διαλύματα, μειώστε το μήκος οπτικής διαδρομής αντί να αποδέχεστε απορρόφηση πολύ πάνω από 1.

Χρησιμοποιήστε ως τυφλό την ίδια ακριβώς μήτρα: νερό ίδιας ποιότητας, ίδιο κλάσμα συνδιαλύτη, ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και άλατα, χωρίς τη χρωστική. Παρασκευάστε τα πρότυπα βαθμονόμησης στην ίδια μήτρα και στην ίδια θερμοκρασία. Κατά την ανάπτυξη, σαρώστε ολόκληρη την ορατή περιοχή, ιδανικά περίπου από 550 έως 750 nm, αντί να μετράτε σε ένα μόνο μήκος κύματος. Παρακολουθήστε το σχήμα, όχι μόνο το ύψος. Αν οι διαδοχικές αραιώσεις μεταβάλλουν το κανονικοποιημένο σχήμα, το σύστημα εξαρτάται χημικά από τη συγκέντρωση. Ένα σταθερό μέγιστο και ένας σταθερός λόγος απορρόφησης στα 610 προς τα 665 nm αποτελούν ισχυρότερες ενδείξεις για ένα αποδεκτό εύρος από ό,τι μόνο μια υψηλή τιμή του R στο τετράγωνο.

Καταγράψτε τη μορφή του αντιδραστηρίου. Το εμπορικό υλικό μπορεί να είναι άνυδρο χλωριούχο μεθυλοθειονίνιο ή μια ένυδρη μορφή, όπως η τριένυδρη, επομένως η μοριακή μάζα που χρησιμοποιείται στους υπολογισμούς του μητρικού διαλύματος πρέπει να αντιστοιχεί στο πραγματικό περιεχόμενο της φιάλης. Αυτό το βήμα από μόνο του εξηγεί μέρος της διαφωνίας μεταξύ των ονομαστικών μοριακών συγκεντρώσεων διαφορετικών εργαστηρίων. Αντίστοιχη πειθαρχία απαιτείται όταν τα αποτελέσματα χρησιμοποιούνται σε υπολογισμούς ποσοτικού προσδιορισμού, όταν τα φάσματα υποστηρίζουν ελέγχους σταθερότητας της σύνθεσης και όταν τα προφίλ προσμείξεων απαιτούν έλεγχο καθαρότητας και προδιαγραφών.

Σύνοψη με καταγεγραμμένες συνθήκες

Χρησιμοποιήστε αυτόν τον πίνακα ως αρχικό πρότυπο για εργαστηριακή καταγραφή, όχι ως πηγή εναλλάξιμων σταθερών.

Το μήκος κύματος απορρόφησης του κυανού του μεθυλενίου είναι, επομένως, μια σύντομη απάντηση με μια εκτενή υποσημείωση. Αναφέρετε την κορυφή που μετρήσατε, στο διάλυμα που μετρήσατε, στη συγκέντρωση που μετρήσατε. Αυτή η πρακτική εμποδίζει μια τιμή αραιού υδατικού διαλύματος κοντά στα 664 nm να μετατραπεί σε ψευδή καθολική σταθερά.