Το κυανό του μεθυλενίου στην έρευνα για το εγκεφαλικό επεισόδιο και την εγκεφαλική υποαιμάτωση: τι δείχνουν πραγματικά τρία μοντέλα

Μια φραγμένη αρτηρία, μια κυτταροκαλλιέργεια που στερείται θρεπτικών συστατικών και ένας αρουραίος με στενωμένες αρτηρίες στον τράχηλο μοιάζουν με τρεις εκδοχές του ίδιου πειράματος. Δεν είναι. Καθένα θέτει διαφορετικό ερώτημα, και το κυανό του μεθυλενίου δίνει διαφορετική απάντηση σε καθένα. Αν τα συγχέουμε, η βιβλιογραφία φαίνεται αντιφατική. Αν τα διαχωρίσουμε, εμφανίζεται ένα σαφές μοτίβο, που καθορίζεται κυρίως από τον χρονισμό.

Αυτός ο διαχωρισμός είναι ο βασικός σκοπός της παρούσας ανασκόπησης. Τα τρία μοντέλα είναι το οξύ εστιακό εγκεφαλικό επεισόδιο, η στέρηση οξυγόνου και γλυκόζης με επανοξυγόνωση σε καλλιεργημένα κύτταρα και η χρόνια εγκεφαλική υποαιμάτωση επί εβδομάδες. Ο προτεινόμενος μηχανισμός που τα συνδέει είναι μιτοχονδριακός, αλλά τα αποτελέσματα διαφέρουν επειδή διαφέρει το μεταβολικό πλαίσιο.

Τα τρία μοντέλα απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα

Το οξύ εστιακό εγκεφαλικό επεισόδιο στους αρουραίους προκαλείται συνήθως με απόφραξη της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας, που αναφέρεται με τη συντομογραφία MCAO. Μια απόφραξη που προσομοιάζει με θρόμβο δημιουργεί έναν ισχαιμικό πυρήνα, ο οποίος περιβάλλεται από μια ισχαιμική παρασκιά: ιστό που απειλείται, αλλά μπορεί δυνητικά να διασωθεί αν αποκατασταθεί η ροή. Το ερώτημα εδώ είναι αν μια παρέμβαση επιβραδύνει την επέκταση του εμφράκτου ή διατηρεί τη λειτουργία κατά την περίοδο της επαναιμάτωσης.

Η στέρηση οξυγόνου και γλυκόζης, με τη συντομογραφία OGD, εξετάζει το πρόβλημα στην αντίθετη κλίμακα. Καλλιεργημένα εγκεφαλικά κύτταρα τοποθετούνται σε συνθήκες σχεδόν μηδενικού οξυγόνου χωρίς γλυκόζη και στη συνέχεια επιστρέφουν σε φυσιολογικό καλλιεργητικό μέσο. Δεν υπάρχει θρόμβος, παράπλευρη κυκλοφορία, αρτηριακή πίεση ή ανοσοποιητικό σύστημα. Το ερώτημα είναι αμιγώς κυτταρικό: τι συμβαίνει στην αναπνοή, στο ATP και στην επιβίωση όταν τα υποστρώματα εξαφανίζονται και μετά επανέρχονται.

Η χρόνια εγκεφαλική υποαιμάτωση χρησιμοποιεί μόνιμη αμφοτερόπλευρη απόφραξη των καρωτίδων στους αρουραίους, γνωστή ως μοντέλο 2VO. Η αιματική ροή προς τον πρόσθιο εγκέφαλο μειώνεται και παραμένει χαμηλή επί εβδομάδες. Δεν υπάρχει αιφνίδιο εστιακό έμφρακτο ούτε επείγουσα επαναιμάτωση. Το ερώτημα είναι αν η μεταβολική υποστήριξη επί εβδομάδες διατηρεί τα αγγεία, τα μιτοχόνδρια και τη μνήμη κατά την παρατεταμένη χαμηλή ροή.

Επομένως, μια βελτίωση της μνήμης μετά από έναν μήνα θεραπείας στο μοντέλο 2VO δεν λέει τίποτα άμεσα για τη διάσωση του ανθρώπινου εγκεφάλου κατά την επείγουσα θρομβεκτομή. Η διάκριση έχει σημασία επειδή οι περισσότερες αισιόδοξες περιλήψεις την παραλείπουν.

Οξύ εγκεφαλικό επεισόδιο: προστασία κατά την επαναιμάτωση, καθυστέρηση χωρίς αυτήν

Το σαφέστερο αποτέλεσμα στην οξεία φάση προέρχεται από παροδική MCAO με επαναιμάτωση. Οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε απόφραξη για 60 λεπτά και στη συνέχεια έλαβαν ενδοφλεβίως κυανό του μεθυλενίου σε χαμηλή δόση, με έναρξη κατά την επαναιμάτωση και επιπλέον δόσεις στις 3 ώρες και την ημέρα 2. Η μαγνητική τομογραφία έδειξε ότι η βλάβη στην ομάδα που έλαβε μόνο το έκδοχο αυξήθηκε κατά περίπου 19 τοις εκατό έως την ημέρα 2, ενώ η βλάβη στην ομάδα θεραπείας συρρικνώθηκε κατά περίπου 17 τοις εκατό, με τελικά έμφρακτα μικρότερα κατά περίπου 30 τοις εκατό και καλύτερες νευρολογικές βαθμολογίες τις ημέρες 2 και 7. Στην απεικόνιση βελτιώθηκε η επιβίωση του ιστού τόσο στον πυρήνα όσο και στην παρασκιά. Η ευρύτερη βιβλιογραφία για τη νευροπροστασία εξετάζει αυτή την προστασία, που συνδέεται χρονικά με την επαναιμάτωση, μαζί με ευρήματα για τη γενικευμένη ισχαιμία και το τραύμα.

Η εικόνα αλλάζει όταν η αρτηρία παραμένει φραγμένη. Σε ένα πείραμα μόνιμης MCAO, το κυανό του μεθυλενίου που χορηγήθηκε κατά τη συνεχιζόμενη ισχαιμία επιβράδυνε την επέκταση της βλάβης στην απεικόνιση διάχυσης και παρέτεινε για λίγο την ασυμφωνία αιμάτωσης-διάχυσης, με ελαφρώς καλύτερη τοπική ροή, αλλά ο τελικός όγκος του εμφράκτου στις 24 ώρες δεν διέφερε σημαντικά. Καθυστέρησε τη μετατροπή του ιστού που βρισκόταν σε κίνδυνο σε έμφρακτο, χωρίς να υποκαθιστά την επαναδιάνοιξη του αγγείου.

Μια τρίτη μελέτη στην οξεία φάση προσθέτει στοιχεία για τον μηχανισμό και τις διαφοροποιήσεις ανάλογα με τη δόση. Μία εφάπαξ ενδοπεριτοναϊκή δόση αμέσως μετά την απόφραξη έδειξε τη μεγαλύτερη μείωση του εμφράκτου, περίπου 50 τοις εκατό, σε μια ενδιάμεση δόση 5 mg/kg και όχι στα 1 ή 10 mg/kg, μαζί με καλύτερες αισθητικοκινητικές βαθμολογίες. Οι συγγραφείς συνέδεσαν αυτό το εύρημα με τη διατήρηση της μιτοχονδριακής δομής και την αυξημένη μιτοφαγία, δηλαδή την επιλεκτική απομάκρυνση των κατεστραμμένων μιτοχονδρίων. Επομένως, η δόση, η οδός και το πρόγραμμα χορήγησης έχουν σημασία, και οι τιμές mg/kg στους αρουραίους δεν αποτελούν δόσεις για το εγκεφαλικό επεισόδιο στον άνθρωπο.

Κυτταροκαλλιέργεια: το ίδιο φάρμακο βοηθά ή βλάπτει ανάλογα με το πότε χορηγείται

Το πείραμα με τα αστροκύτταρα είναι το πιο διδακτικό και εκείνο που αποδίδεται συχνότερα λανθασμένα. Πρωτογενή αστροκύτταρα από τον εγκεφαλικό φλοιό ποντικών υποβλήθηκαν σε 6 ώρες σοβαρής στέρησης με 0.1 τοις εκατό οξυγόνο, σε μέσο χωρίς γλυκόζη, πυροσταφυλικό ή ορό, και ακολούθησαν 24 ώρες επανοξυγόνωσης με αποκατάσταση των υποστρωμάτων. Περίπου τα μισά κύτταρα πέθαναν, αφήνοντας έτσι στη δοκιμασία περιθώριο να αναδείξει επίδραση προς οποιαδήποτε κατεύθυνση.

Όταν το κυανό του μεθυλενίου ήταν παρόν κατά τη φάση της στέρησης, η επιβίωση επιδεινώθηκε αντί να βελτιωθεί. Όταν, αντίθετα, προστέθηκε κατά την επανοξυγόνωση, χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις βελτίωσαν τη βιωσιμότητα και αύξησαν την κατανάλωση οξυγόνου, την πρόσληψη γλυκόζης και την παραγωγή ATP. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, οι ίδιες συγκεντρώσεις αύξησαν την πρόσληψη γλυκόζης κατά περίπου 89 τοις εκατό στα 0.1 μικρομοριακά και περίπου 200 τοις εκατό στο 1 μικρομοριακό, με διατήρηση του γλυκογόνου και της δραστηριότητας της εξοκινάσης μετά τη βλάβη και χωρίς μετρημένη αύξηση του υπεροξειδικού ανιόντος.

Ο μηχανισμός γίνεται ευκολότερα κατανοητός με μια αναλογία προς μια εφεδρική γεννήτρια. Το κυανό του μεθυλενίου δρα ως εναλλακτικός φορέας ηλεκτρονίων που δέχεται αναγωγικά ισοδύναμα και τα μεταφέρει προς το κυτόχρωμα c και το σύμπλοκο IV, υποστηρίζοντας τη ροή ηλεκτρονίων και τη σύνθεση ATP, ενώ μειώνει τη διαρροή ηλεκτρονίων στα προηγούμενα στάδια. Κατά τη σοβαρή στέρηση, αυτή η διέγερση αποτελεί μειονέκτημα, επειδή αυξάνει τις μεταβολικές απαιτήσεις όταν το οξυγόνο και η γλυκόζη σχεδόν απουσιάζουν, κάτι που μπορεί να εξαντλήσει τα τελευταία αποθέματα ταχύτερα. Μετά την επάνοδο των υποστρωμάτων, η ίδια ιδιότητα γίνεται πλεονέκτημα, επειδή βοηθά τα κατεστραμμένα μιτοχόνδρια να αξιοποιήσουν αποτελεσματικά το οξυγόνο και τη γλυκόζη που έχουν αποκατασταθεί. Γι’ αυτό και τα ευρήματα από επεξηγηματικά κείμενα για τη μιτοχονδριακή μεταφορά ηλεκτρονίων χρειάζεται να συνοδεύονται από το πλαίσιο της στέρησης.

Μια επιφύλαξη: αυτός ο κανόνας χρονισμού αφορά τη συγκεκριμένη πειραματική καλλιέργεια αστροκυττάρων. Μια συναφής κυτταρική μελέτη με διαφορετικό τύπο κυττάρων, ηπιότερη στέρηση και χαμηλότερη συγκέντρωση διαπίστωσε προστασία ακόμη και με έκθεση κατά τη στέρηση. Ο τύπος των κυττάρων, το εναπομένον οξυγόνο, η συγκέντρωση και το πρωτόκολλο καθορίζουν την κατεύθυνση της επίδρασης.

Χρόνια χαμηλή ροή: μνήμη, οξειδάση του κυτοχρώματος και αγγεία σε βάθος εβδομάδων

Τα πειράματα χρόνιας υποαιμάτωσης χρησιμοποίησαν καθημερινή θεραπεία χαμηλής δόσης επί εβδομάδες, όχι μια εφάπαξ επείγουσα δόση εφόδου. Στην πρώτη μελέτη, αρουραίοι με μόνιμη απόφραξη των καρωτίδων έλαβαν 4 mg/kg καθημερινά για έναν μήνα, μετά από κάθε καθημερινή συνεδρία εκπαίδευσης, ώστε να στοχεύεται η εδραίωση της μνήμης και όχι η άμεση επίδοση. Τα ζώα με απόφραξη μάθαιναν βραδύτερα τις δοκιμασίες οπτικής διάκρισης και είχαν χειρότερη επίδοση σε μια απαιτητική δοκιμασία μνήμης, ενώ η ικανότητα κολύμβησης, η κινητική δραστηριότητα και η αναγνώριση οσμών δεν επηρεάστηκαν. Η καθημερινή θεραπεία μετρίασε τα ελλείμματα μάθησης και μνήμης χωρίς να αλλάξει τη γενική κινητική συμπεριφορά.

Μια επακόλουθη μελέτη χαρτογράφησε την οξειδάση του κυτοχρώματος, δηλαδή το μιτοχονδριακό σύμπλοκο IV, σε 44 εγκεφαλικές περιοχές μετά το ίδιο σχήμα διάρκειας ενός μήνα. Η απόφραξη μείωσε τη δραστηριότητα του ενζύμου στον οπτικό, στον προμετωπιαίο και στον περιρινικό φλοιό, καθώς και στον ιππόκαμπο και στην αμυγδαλή, και εξασθένησε τη συντονισμένη δραστηριότητα μεταξύ οπτικού φλοιού και ιπποκάμπου. Η θεραπεία διατήρησε την τοπική δραστηριότητα του ενζύμου και ενίσχυσε αυτές τις μεταβολικές συσχετίσεις μεταξύ περιοχών, ενώ η διατηρημένη δραστηριότητα συσχετίστηκε με καλύτερη επίδοση στις δοκιμασίες. Αυτές οι συσχετίσεις περιγράφουν συντονισμένη δραστηριότητα μεταβολικών ενζύμων, όχι άμεσες μετρήσεις της λειτουργικής συνδεσιμότητας στον άνθρωπο, μια διάκριση που οι ανασκοπήσεις για τον ενεργειακό μεταβολισμό του εγκεφάλου βοηθούν να παραμένει σαφής.

Μια ξεχωριστή μελέτη διάρκειας μίας εβδομάδας χρησιμοποίησε 2 mg/kg καθημερινά και πρόσθεσε έναν αναστολέα σηματοδοτικής οδού για να ελέγξει τον μηχανισμό. Με τη θεραπεία, η εγκεφαλική αιματική ροή αυξήθηκε από περίπου 60 σε περίπου 100 mL ανά 100 g ανά λεπτό, και η αγγειακή πυκνότητα στον ιππόκαμπο αυξήθηκε από περίπου 15.1 σε 23 τοις εκατό. Και οι δύο αυξήσεις αντιστράφηκαν εν μέρει όταν αναστάλθηκε η οδός κυτταρικής επιβίωσης PI3K/Akt, ενώ η φωσφορυλιωμένη Akt αυξήθηκε με τη θεραπεία. Τα ευρήματα για την αιματική ροή, την αγγειακή πυκνότητα, τον φραγμό και τους νευρώνες υποδεικνύουν νευροαγγειακή προστασία συνδεδεμένη με τη σηματοδότηση PI3K/Akt και όχι μια αμιγώς μεταβολική επίδραση.

Γιατί τίποτε από αυτά δεν ισοδυναμεί με επείγουσα φροντίδα για το εγκεφαλικό επεισόδιο

Ο έλεγχος των εργαστηριακών συνθηκών είναι ο λόγος για τον οποίο αυτά τα αποτελέσματα δεν μεταφέρονται άμεσα στην κλινική πράξη. Τα καλλιεργημένα κύτταρα δεν έχουν θρόμβο ούτε φαρμακοκινητική. Το μοντέλο 2VO αφορά παρατεταμένη, γενικευμένη χαμηλή ροή και όχι μια αιφνίδια εστιακή εμβολή με παρασκιά που έχει σχηματιστεί μόλις πριν από λίγα λεπτά. Ακόμη και η MCAO στους αρουραίους χρησιμοποιεί νεαρά, υγιή ζώα, αναισθησία, ομοιόμορφες αποφράξεις και χορήγηση δόσεων με ακριβή χρονισμό, σε αντίθεση με τους μεγαλύτερης ηλικίας ασθενείς που έχουν ποικίλους θρόμβους, αθηροσκλήρωση, υπέρταση, διαβήτη και άγνωστους χρόνους έναρξης.

Καμία δημοσιευμένη τυχαιοποιημένη μελέτη σε ανθρώπους δεν έχει τεκμηριώσει το κυανό του μεθυλενίου ως επείγουσα θεραπεία για το οξύ ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο. Μια μελέτη απεικόνισης σε ανθρώπους, που αναφέρεται μερικές φορές, συμπεριέλαβε 26 υγιείς ενήλικες, όχι ασθενείς με εγκεφαλικό επεισόδιο, και μια εφάπαξ δόση από το στόμα μεταβάλλει τα εγκεφαλικά σήματα που σχετίζονται με την εκτέλεση δοκιμασιών, με μικρή βελτίωση στην ανάκληση. Αυτό δείχνει δράση στο κεντρικό νευρικό σύστημα, όχι αποτελεσματικότητα στο εγκεφαλικό επεισόδιο. Αντίθετα, οι τρέχουσες οδηγίες επείγουσας αντιμετώπισης επικεντρώνονται στην ταχεία επαναιμάτωση με ενδοφλέβια θρομβόλυση σε ασθενείς που πληρούν τα κριτήρια και στη θρομβεκτομή για κατάλληλες περιπτώσεις απόφραξης μεγάλων αγγείων, ενώ τα καθιερωμένα πρωτόκολλα επείγουσας αντιμετώπισης του εγκεφαλικού επεισοδίου παραμένουν η μόνη αποδεδειγμένη προσέγγιση. Η αντιμετώπιση ύποπτου εγκεφαλικού επεισοδίου δεν πρέπει ποτέ να καθυστερεί για τη χορήγηση κυανού του μεθυλενίου, και οι πρακτικοί περιορισμοί της αναγωγής προκλινικών δόσεων εξηγούν γιατί τα προγράμματα χορήγησης στους αρουραίους δεν μπορούν να ερμηνεύονται ως κλινικά σχήματα.

Τα δεδομένα ασφάλειας ενισχύουν αυτό το όριο. Το ενδοφλέβιο κυανό του μεθυλενίου φέρει προειδοποίηση σε πλαίσιο για σοβαρό ή θανατηφόρο σύνδρομο σεροτονίνης όταν συνδυάζεται με σεροτονινεργικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων των SSRIs, SNRIs και αναστολέων MAO, τα οποία λαμβάνουν πολλοί ασθενείς στις ηλικίες όπου εμφανίζονται εγκεφαλικά επεισόδια. Αντενδείκνυται στην ανεπάρκεια G6PD λόγω του κινδύνου αιμόλυσης. Αναστέλλει επίσης τη σηματοδότηση του μονοξειδίου του αζώτου, γεγονός που αυξάνει την αγγειακή αντίσταση και την πίεση σε ορισμένες συνθήκες, οπότε δεν πρέπει να περιγράφεται απλώς ως φάρμακο που αυξάνει την αιματική ροή στον εγκέφαλο. Το εγκεκριμένο ενδοφλέβιο σχήμα 1 mg/kg για την επίκτητη μεθαιμοσφαιριναιμία δεν είναι σχήμα για το εγκεφαλικό επεισόδιο.

Το ειλικρινές συμπέρασμα είναι περιορισμένο, αλλά ουσιαστικό. Κατά την περίοδο της επαναιμάτωσης στην παροδική εστιακή ισχαιμία, το κυανό του μεθυλενίου σε χαμηλή δόση περιόρισε την εξέλιξη της βλάβης στους αρουραίους. Σε συνθήκες μόνιμης απόφραξης, καθυστέρησε αλλά δεν απέτρεψε το έμφρακτο. Στα αστροκύτταρα, έβλαψε κατά τη σοβαρή στέρηση και βοήθησε κατά την επανοξυγόνωση. Κατά τη χρόνια υποαιμάτωση, διατήρησε την οξειδάση του κυτοχρώματος, τα αγγεία και τη μνήμη επί εβδομάδες. Ένας φορέας ηλεκτρονίων, τρία πλαίσια, τρεις απαντήσεις.