Κυανό του μεθυλενίου και Bartonella: εργαστηριακά ευρήματα και όρια της κλινικής τεκμηρίωσης

Ένα τρυβλίο καλλιέργειας και ένας ασθενής μοιράζονται μια λέξη, τη λοίμωξη, αλλά όχι την ίδια έννοια. Στο τρυβλίο, η λοίμωξη είναι ένας αριθμός αποικιών σε άγαρ. Στον ασθενή, είναι βακτήρια μέσα σε κύτταρα και αγγεία, φάρμακα που μετακινούνται μέσω του αίματος και των ιστών και ένα ανοσοποιητικό σύστημα που αναλαμβάνει μέρος της δουλειάς. Αν συγχέουμε τα δύο, ένας εντυπωσιακός εργαστηριακός αριθμός αρχίζει να μοιάζει με θεραπεία. Αν τα διατηρούμε χωριστά, ο ίδιος αριθμός γίνεται αυτό που πραγματικά είναι: ένας λόγος για να γίνει το επόμενο πείραμα.

Αυτή η διάκριση είναι ολόκληρος ο σκοπός της παρούσας ανασκόπησης για το κυανό του μεθυλενίου και τη Bartonella. Δύο εργαστηριακές μελέτες από μία ερευνητική ομάδα δοκίμασαν το κυανό του μεθυλενίου έναντι της Bartonella henselae σε καταστάσεις μη ανάπτυξης. Και οι δύο ανέφεραν ισχυρή δράση σε γυάλινα και πλαστικά εργαστηριακά σκεύη. Καμία δεν το δοκίμασε σε άνθρωπο.

Γιατί οι ερευνητές εξετάζουν τη στατική φάση

Οι περισσότερες δοκιμές αντιβιοτικών χρησιμοποιούν κύτταρα που αναπτύσσονται. Αυτό το μοντέλο παραβλέπει μια δυσκολότερη περίπτωση: κύτταρα που έχουν σταματήσει να διαιρούνται και ανέχονται φάρμακα τα οποία θανατώνουν τα αντίστοιχα αναπτυσσόμενα κύτταρα.

Η Bartonella μπορεί να παραμένει στον οργανισμό, μεταξύ άλλων μέσα σε ερυθροκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα. Έτσι, η ομάδα διερεύνησε ποια εγκεκριμένα φάρμακα μπορούν να θανατώσουν τη B. henselae αφού εισέλθει στη στατική φάση. Μια χαμηλή ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) έναντι αναπτυσσόμενων κυττάρων δεν προέβλεπε τη θανάτωση στη στατική φάση. Η ριφαμπικίνη είχε πολύ χαμηλή MIC, αλλά περιόριζε ελάχιστα τα κύτταρα της στατικής φάσης, ενώ ενώσεις με υψηλότερες τιμές MIC τα θανάτωναν αποτελεσματικά. Οι αναγνώστες που επιθυμούν μια γενική μέθοδο ανάγνωσης αυτού του είδους δημοσιεύσεων θα τη βρουν στον οδηγό για την ανάγνωση ερευνών σχετικά με το κυανό του μεθυλενίου.

Πρώτος έλεγχος διαλογής: Li και συνεργάτες, 2019

Ο έλεγχος διαλογής στη στατική φάση του 2019 στο Antibiotics χρησιμοποίησε ένα μόνο στέλεχος, το B. henselae JK53, το οποίο καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο Schneider με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, στους 37 C με 5 τοις εκατό CO2. Οι καλλιέργειες μίας ημέρας αποτελούνταν κυρίως από διάσπαρτα διαιρούμενα κύτταρα. Οι καλλιέργειες πέντε ημερών, με περίπου 10 στην 8η μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά mL, θεωρήθηκαν καλλιέργειες στατικής φάσης και περιείχαν ορατά συσσωματώματα.

Η δοκιμασία χρησιμοποιούσε SYBR Green I με ιωδιούχο προπίδιο, με βαθμονόμηση έναντι μειγμάτων ζωντανών κυττάρων και κυττάρων που είχαν θανατωθεί με ισοπροπανόλη. Επειδή το κυανό του μεθυλενίου έχει έντονο χρώμα, τα θετικά ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με μικροσκοπία και στη συνέχεια με καταμέτρηση αποικιών σε αιματούχο άγαρ, το αυστηρότερο καταληκτικό σημείο.

Από 1,581 εγκεκριμένα φάρμακα σε συγκέντρωση 50 micromolar, το κυανό του μεθυλενίου άφησε βιωσιμότητα 16 τοις εκατό σύμφωνα με τον αναγνώστη μικροπλακών και 25 τοις εκατό σύμφωνα με τη μικροσκοπία. Η δαπτομυκίνη έδωσε 21 τοις εκατό, αρκετές αζόλες 22 έως 27 τοις εκατό, η γενταμικίνη 32 τοις εκατό, η ερυθρομυκίνη 66 τοις εκατό και η σιπροφλοξασίνη 74 τοις εκατό. Το παμοϊκό πυρβίνιο φάνηκε ισχυρότερο στον αναγνώστη, αλλά δεν μπορούσε να αξιολογηθεί με μικροσκοπία λόγω του δικού του φθορισμού.

Έναντι αναπτυσσόμενης B. henselae, η MIC του κυανού του μεθυλενίου ήταν 0.08 έως 0.16 micrograms per mL. Έναντι κυττάρων στατικής φάσης πέντε ημερών, σε συγκέντρωση 5 micrograms per mL, ο αριθμός αποικιών μειώθηκε σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα μετά από μία ημέρα έκθεσης, όπως συνέβη και με τη δαπτομυκίνη και το παμοϊκό πυρβίνιο στις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν. Μια ξεχωριστή δοκιμή θανάτωσης σε συνάρτηση με τον χρόνο χρησιμοποίησε 10 micrograms per mL. Αυτά είναι εργαστηριακά επίπεδα έκθεσης, όχι δόσεις, και η δημοσίευση τα αναφέρει ως τέτοια. Μια παρατιθέμενη τιμή μέγιστης συγκέντρωσης στο ανθρώπινο πλάσμα, κοντά στα 3.9 micrograms per mL, εμφανίζεται στη δημοσίευση μόνο ως πληροφορία υποβάθρου. Η επισκόπηση της φαρμακοκινητικής του κυανού του μεθυλενίου εξηγεί γιατί μια τιμή στο πλάσμα δεν μπορεί να ερμηνευτεί ως τιμή στους ιστούς.

Η δημοσίευση αναφέρει ρητά δύο περιορισμούς. Δεν υπήρχε μοντέλο βιοϋμενίου ούτε δοκιμή συνδυασμών με κυανό του μεθυλενίου. Τα συσσωματώματα πέντε ημερών ήταν ομάδες κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια στατικής φάσης, όχι ένα επικυρωμένο πείραμα βιοϋμενίου. Οι συγγραφείς ζήτησαν μελέτες σε ζώα, μελέτες συνδυασμών, μελέτες βιοϋμενίων και δοκιμές σε άλλα είδη Bartonella.

Συνδυασμοί και κύτταρα προερχόμενα από βιοϋμένια: Zheng και συνεργάτες, 2020

Η μελέτη συνέχειας του 2020 στο BMC Microbiology διατήρησε το ίδιο στέλεχος και θρεπτικό μέσο, αλλά χρησιμοποίησε καλλιέργειες στατικής φάσης έξι ημερών και πρόσθεσε δύο στοιχεία που έλειπαν από την πρώτη δημοσίευση: συνδυασμούς δύο φαρμάκων και ένα μοντέλο κυττάρων προερχόμενων από βιοϋμένιο.

Για μεμονωμένα φάρμακα σε ενιαία συγκέντρωση 5 micrograms per mL επί 24 ώρες, το κυανό του μεθυλενίου άφησε 3.2 επί 10 στην 4η μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά mL, έναντι περίπου 2.8 επί 10 στη 10η στον μάρτυρα. Η σιπροφλοξασίνη, η γενταμικίνη και η νιτροφουραντοΐνη άφησαν λιγότερες αποικίες στο ίδιο χρονικό σημείο. Αυτό διαφέρει από το αποτέλεσμα του 2019, όπου το ίδιο ονομαστικό επίπεδο δεν έδωσε ανιχνεύσιμες αποικίες μετά από μία ημέρα. Η ηλικία, η πυκνότητα και ο χειρισμός των καλλιεργειών διέφεραν, επομένως η θανάτωση ήταν αναπαραγώγιμη ως προς την κατεύθυνση του αποτελέσματος, αλλά όχι ταυτόσημη ως προς το μέγεθός του. Αυτή η μεταβολή μεταξύ πειραματικών δοκιμών είναι ένας λόγος για τον οποίο οι συνήθεις έλεγχοι ασφάλειας και αλληλεπιδράσεων αντιμετωπίζουν την εργαστηριακή δραστικότητα ως διαφορετική από την κλινική επίδραση.

Ο έλεγχος διαλογής συνδυασμών είναι το μέρος που αναφέρεται συχνότερα. Κάθε συστατικό διατηρήθηκε στα 5 micrograms per mL. Τόσο η αζιθρομυκίνη μαζί με κυανό του μεθυλενίου όσο και η ριφαμπικίνη μαζί με κυανό του μεθυλενίου δεν έδωσαν ανιχνεύσιμες αποικίες στατικής φάσης στις 24 ώρες, όπως και οι δύο συνδυασμοί με σιπροφλοξασίνη. Μόνο αυτοί οι τέσσερις από τους 25 συνδυασμούς που δοκιμάστηκαν έδωσαν αυτό το αποτέλεσμα. Δεν πραγματοποιήθηκε τυπική ανάλυση συνέργειας, επομένως ο σωστός όρος είναι ενεργός συνδυασμός υπό αυτές τις συνθήκες, όχι αποδεδειγμένη συνέργεια.

Το πείραμα βιοϋμενίου εξέτασε κύτταρα που ανακτήθηκαν από ένα νεαρό βιοϋμένιο το οποίο είχε διασπαστεί, όχι τη διείσδυση σε ένα άθικτο ώριμο βιοϋμένιο. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν για πέντε ημέρες, αραιώθηκαν σε μικροπλάκες για άλλες πέντε ημέρες, επιβεβαιώθηκαν με χρώση κρυσταλλικού ιώδους και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με απόξεση πριν από την έκθεση στα φάρμακα. Στα 5 micrograms per mL, το κυανό του μεθυλενίου μόνο του μείωσε τον αριθμό σε 2.3 επί 10 στη 2η έως την ημέρα 6, κατατασσόμενο μεταξύ των καλύτερων μεμονωμένων παραγόντων, αλλά όχι στο μηδέν. Και οι δύο συνδυασμοί με κυανό του μεθυλενίου έφτασαν στο μηδέν έως την ημέρα 6, όπως και οι δύο συνδυασμοί με σιπροφλοξασίνη.

Οι συγγραφείς επισήμαναν τους ίδιους περιορισμούς που θα εντόπιζε ένας προσεκτικός αναγνώστης: νεαρό βιοϋμένιο που είχε συλλεχθεί με απόξεση αντί για παλαιό άθικτο βιοϋμένιο, μία συγκέντρωση επιλεγμένη για πρακτικούς λόγους για όλα τα φάρμακα αντί για κάθε φάρμακο στη δική του ρεαλιστική μέγιστη συγκέντρωση, μόνο επιλεγμένους συνδυασμούς με βάση την αζιθρομυκίνη ή τη ριφαμπικίνη, ένα στέλεχος, κανένα ζώο και κανέναν ασθενή. Μεταγενέστερη έρευνα με τρία φάρμακα προτάθηκε, αλλά δεν αναφέρθηκαν αποτελέσματά της.

Σύγκριση σχεδιασμού των μελετών

Ο πίνακας συνοψίζει το βασικό μήνυμα αυτού του άρθρου. Όλα όσα βρίσκονται αριστερά από την τελευταία στήλη αφορούν εργασίες σε καλλιέργειες. Τίποτα σε καμία από τις δύο δημοσιεύσεις δεν ανήκει στην τελευταία στήλη.

Η Bartonella δεν είναι Borrelia

Και οι δύο δημοσιεύσεις αναφέρουν τη Borrelia burgdorferi, τη σπειροχαίτη της νόσου Lyme, επειδή η δοκιμασία με χρωστικές προήλθε από προηγούμενη έρευνα για τη στατική φάση της Borrelia στο ίδιο εργαστήριο, όπου το κυανό του μεθυλενίου και η δαπτομυκίνη είχαν επίσης αναδειχθεί ως δραστικές ουσίες. Αυτό το ιστορικό παρέχει χρήσιμο πλαίσιο, αλλά αποτελεί και συχνή πηγή σφαλμάτων.

Κανένα πείραμα σε καμία από τις δύο δημοσιεύσεις για τη Bartonella δεν εξετάζει τη Borrelia παράλληλα με τη Bartonella. Οι μικροοργανισμοί διαφέρουν, τα θρεπτικά μέσα διαφέρουν, οι συγκεντρώσεις διαφέρουν και η υποτιθέμενη επίδραση του κυανού του μεθυλενίου στη μεμβράνη της Bartonella διατυπώθηκε ως εικασία που απαιτεί περαιτέρω μελέτη. Τα αποτελέσματα δεν πρέπει να μεταφέρονται από το ένα είδος στο άλλο, και καμία από τις δύο δημοσιεύσεις δεν υποστηρίζει γενικούς ισχυρισμούς για παράσιτα. Για αυτόν τον λόγο, η σύγκριση των επίμονων κυττάρων Borrelia και Bartonella διατηρεί τις δύο βιβλιογραφίες χωριστές.

Γιατί οι καλλιέργειες δεν μετατρέπονται σε πρωτόκολλο

Το ενδιαφέρον αναζήτησης για ένα πρωτόκολλο κυανού του μεθυλενίου για τη Bartonella είναι κατανοητό. Αυτές οι δημοσιεύσεις εξηγούν γιατί η συγκεκριμένη φράση πρέπει να αντιμετωπίζεται ως προειδοποιητικό σημάδι και όχι ως λίστα αγορών.

Πρώτον, τα 5 micrograms per mL σε ένα φρεάτιο δεν αποτελούν συνταγή. Δεν συνοδεύονται από δεδομένα απορρόφησης, κατανομής, σύνδεσης με πρωτεΐνες, ενδοκυττάριας διείσδυσης ή ανεκτικότητας. Οι συγγραφείς επέλεξαν αυτή τη συγκέντρωση ως έναν κατά προσέγγιση μέσο όρο των μέγιστων συγκεντρώσεων αντιβιοτικών και δήλωσαν ότι οι μελλοντικές εργασίες πρέπει να χρησιμοποιούν κάθε φάρμακο στο δικό του ρεαλιστικό επίπεδο.

Δεύτερον, μηδέν αποικίες σημαίνει ότι δεν υπάρχουν αποικίες υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες επίστρωσης, όχι ότι ο ιστός είναι στείρος. Τα επίμονα κύτταρα, τα ενδοκυττάρια βακτήρια και οι περιορισμοί δειγματοληψίας βρίσκονται όλα εκτός του τρυβλίου άγαρ.

Τρίτον, συνδυασμοί που αποστειρώνουν ένα φρεάτιο μπορεί να αποτύχουν ή να προκαλέσουν βλάβη μέσα σε έναν οργανισμό. Η αζιθρομυκίνη μαζί με κυανό του μεθυλενίου και η ριφαμπικίνη μαζί με κυανό του μεθυλενίου είναι εργαστηριακοί συνδυασμοί σε εργαστηριακά επίπεδα έκθεσης. Χωρίς φαρμακοκινητική σε ζώα και ελεγχόμενα δεδομένα σε ανθρώπους, δεν υπάρχει δόση, διάρκεια ή σχέση οφέλους προς κίνδυνο. Όποιος εξετάζει επιλογές πρέπει να τις συζητήσει με γιατρό και να διαβάσει πότε η χρήση κυανού του μεθυλενίου χρειάζεται ιατρική επίβλεψη, πριν καταλήξει σε οποιοδήποτε συμπέρασμα από δεδομένα τρυβλίων.

Το περιορισμένο συμπέρασμα που πράγματι υποστηρίζουν αυτές οι δημοσιεύσεις είναι το εξής: το κυανό του μεθυλενίου έχει αναπαραγώγιμη δράση έναντι μη αναπτυσσόμενης B. henselae JK53 in vitro, μεταξύ άλλων σε εργαστηριακούς συνδυασμούς δύο φαρμάκων, με τα ισχυρότερα αποτελέσματα για συνδυασμούς και κύτταρα προερχόμενα από βιοϋμένια να προέρχονται από τη μελέτη του 2020. Όλα τα υπόλοιπα, συμπεριλαμβανομένου του κατά πόσον αυτή η δράση έχει σημασία για τη βαρτονέλλωση στον άνθρωπο, παραμένουν αδοκίμαστα.