Άγαρ EMB έναντι άγαρ MacConkey: επιλογή και ερμηνεία μέσων

Ένας φοιτητής ενοφθαλμίζει με γραμμώσεις το ίδιο δείγμα νερού σε δύο τρυβλία. Στο ένα εμφανίζονται σκούρες αποικίες με πράσινη μεταλλική λάμψη. Στο άλλο εμφανίζονται έντονα ροζ αποικίες με θολή άλω. Και τα δύο τρυβλία ενοφθαλμίστηκαν από τον ίδιο σωλήνα, επωάστηκαν δίπλα δίπλα και διαβάστηκαν την ίδια ώρα. Ο φοιτητής ρωτά ποιο τρυβλίο είναι σωστό.

Και τα δύο τρυβλία είναι σωστά. Απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα. Η σύγχυση προκύπτει όταν τα δύο μέσα αντιμετωπίζονται ως εναλλάξιμοι έλεγχοι για εντερικά βακτήρια. Μοιράζονται έναν σκοπό, δηλαδή να επιλέγουν Gram-αρνητικούς εντερικούς οργανισμούς και να διαχωρίζουν τους ζυμωτές λακτόζης από τους μη ζυμωτές, αλλά υλοποιούν αυτόν τον σκοπό με διαφορετική χημεία και διαφορετική οπτική λογική. Μόλις κατανοήσετε τις δύο υποκείμενες αρχές, η επιλογή του τρυβλίου και η ανάγνωση των αποικιών γίνονται διαδικασίες ρουτίνας.

Η σύντομη απάντηση

Το άγαρ EMB χρησιμοποιεί δύο χρωστικές, ηωσίνη Y και κυανούν του μεθυλενίου, οι οποίες επιτελούν διπλό ρόλο: καταστέλλουν την ανάπτυξη Gram-θετικών οργανισμών και καθιζάνουν γύρω από ισχυρούς παραγωγούς οξέος, δημιουργώντας σκούρες αποικίες, κλασικά με μεταλλική πράσινη λάμψη για το Escherichia coli. Το άγαρ MacConkey διαχωρίζει τις λειτουργίες: τα χολικά άλατα μαζί με το κρυσταλλικό ιώδες καταστέλλουν τα Gram-θετικά, η λακτόζη παρέχει υπόστρωμα για ζύμωση και το ουδέτερο ερυθρό υποδεικνύει την παραγωγή οξέος με ροζ ή κόκκινες αποικίες. Αν ο στόχος είναι μια έντονη τεκμαιρόμενη επίδειξη του E. coli, το EMB έχει σαφή χρησιμότητα. Αν ο στόχος είναι ένας καθαρός διαχωρισμός ροζ έναντι άχρωμων αποικιών μεταξύ ζυμωτών και μη ζυμωτών λακτόζης, ιδιαίτερα σε ροές εργασίας κοπράνων ή ούρων, το MacConkey συνήθως διαβάζεται ευκολότερα. Κανένα τρυβλίο δεν ταυτοποιεί έναν οργανισμό μόνο από το χρώμα.

EMB: χρωστικές που επιλέγουν και υποδεικνύουν ταυτόχρονα

Η αρχή του EMB ενσωματώνει την επιλογή και την ένδειξη στα ίδια μόρια. Το πρωτόκολλο της ASM για άγαρ ηωσίνης-κυανού του μεθυλενίου περιγράφει το EMB ως εκλεκτικό και διαφορικό μέσο, στο οποίο το ζεύγος χρωστικών αναστέλλει πολλούς Gram-θετικούς οργανισμούς, ενώ η ζύμωση της λακτόζης οδηγεί σε πρόσληψη και καθίζηση των χρωστικών. Μια τυπική σύνθεση Levine περιέχει πεπτόνη, λακτόζη, φωσφορικό άλας, ηωσίνη Y, κυανούν του μεθυλενίου και άγαρ, όπως αναφέρεται στη μέθοδο FDA BAM για άγαρ Levine EMB. Σημειώστε ότι ορισμένες παλαιότερες συνταγές EMB πρόσθεταν σακχαρόζη μαζί με λακτόζη, ενώ το Levine EMB περιέχει λακτόζη χωρίς σακχαρόζη, γι' αυτό καταγράφετε ποια σύνθεση διαθέτει το εργαστήριό σας.

Η ανάγνωση του EMB σημαίνει ανάγνωση της συμπεριφοράς των χρωστικών. Η έντονη ζύμωση της λακτόζης παράγει αρκετό οξύ ώστε να προκαλέσει έντονη καθίζηση της χρωστικής, προσδίδοντας στο E. coli σκούρα κυανομέλανα κέντρα και, στην κλασική περίπτωση, πράσινη μεταλλική λάμψη σε ανακλώμενο φως. Ασθενέστεροι ζυμωτές, όπως τα Enterobacter και Klebsiella, συνήθως αναπτύσσονται ως ροζ έως μωβ βλεννώδεις αποικίες χωρίς αυτή τη λάμψη. Μη ζυμωτές, όπως τα Salmonella, Shigella και Proteus, γενικά αναπτύσσονται ως άχρωμες ή ημιδιαφανείς αποικίες, επειδή δεν παράγουν την απότομη αύξηση οξέος που προκαλεί την καθίζηση των χρωστικών. Τα Gram-θετικά συνήθως καταστέλλονται, αν και ο βαθμός καταστολής ποικίλλει ανάλογα με το στέλεχος και το προϊόν. Η πλήρης χημεία παρασκευής των χρωστικών, συμπεριλαμβανομένου του λόγου για τον οποίο το κυανούν του μεθυλενίου συμπεριφέρεται εξαρχής ως κατιονική χρωστική, ανήκει σε ξεχωριστή συζήτηση για τις συνθέσεις χρωστικών, ενώ το γενικό πλαίσιο μικροσκοπίας βρίσκεται σε έναν άτλαντα μεθόδων χρώσης. Το παρόν άρθρο επικεντρώνεται στην επιλογή και την ανάγνωση των τρυβλίων.

Η παραπάνω εικόνα είναι ενδεικτική. Δείχνει την αναμενόμενη οπτική λογική: σκούρες αποικίες με λάμψη, μαζί με ροζ βλεννώδεις τύπους και ωχρούς τύπους στο EMB, σε αντιπαραβολή με ροζ έναντι ωχρών τύπων στο MacConkey. Χρησιμοποιήστε την για να μάθετε το μοτίβο και στη συνέχεια επιβεβαιώνετε κάθε εκτίμηση με φωτογραφημένους μάρτυρες και το ένθετο του προϊόντος για το ακριβές μέσο που χρησιμοποιείτε στον πάγκο εργασίας.

MacConkey: διαχωρισμένες λειτουργίες, απλούστερος οπτικός κανόνας

Η αρχή του MacConkey αναθέτει κάθε λειτουργία σε διαφορετικό συστατικό. Το πρωτόκολλο της ASM για άγαρ MacConkey παρουσιάζει το ίδιο πλαίσιο εκλεκτικού και διαφορικού μέσου, ενώ η μέθοδος FDA BAM για άγαρ MacConkey παραθέτει τα λειτουργικά συστατικά: πεπτόνες, λακτόζη, χολικά άλατα, άλας, ουδέτερο ερυθρό, κρυσταλλικό ιώδες και άγαρ. Τα χολικά άλατα μαζί με το κρυσταλλικό ιώδες επιλέγουν έναντι των Gram-θετικών. Η λακτόζη παρέχει το υπόστρωμα ζύμωσης. Το ουδέτερο ερυθρό λειτουργεί ως δείκτης pH, μετατρεπόμενο σε ροζ έως κόκκινο όπου σχηματίζεται οξύ, μερικές φορές με καθίζηση χολής γύρω από ισχυρούς ζυμωτές.

Ο κανόνας ανάγνωσης είναι σκόπιμα απλός: ροζ σημαίνει ζυμωτής λακτόζης, άχρωμο ή ωχρό σημαίνει μη ζυμωτής. Το E. coli εμφανίζεται ροζ έως κόκκινο, συχνά με άλω καθιζήματος χολής. Τα Klebsiella και Enterobacter εμφανίζονται ροζ και συχνά βλεννώδη λόγω των καψών τους. Τα Salmonella, Shigella, Proteus και πολλά άλλα Gram-αρνητικά ραβδία εμφανίζονται άχρωμα. Ένα επιπλέον πλεονέκτημα έχει σημασία στα εκπαιδευτικά εργαστήρια: τα χολικά άλατα γενικά μειώνουν το φαινόμενο σμηνουργίας του Proteus, οπότε είναι ευκολότερο να ληφθούν απομονωμένες αποικίες στο MacConkey απ' ό,τι σε μη εκλεκτικά μέσα, αν και η καταστολή δεν είναι απόλυτη και υπάρχουν εναλλακτικές χωρίς άλατα όταν ο έλεγχος της σμηνουργίας αποτελεί προτεραιότητα.

Ο μοριακός λόγος για τον οποίο οι χρωστικές συμπεριφέρονται έτσι ανάγεται στο φορτίο και τη δομή. Το κυανούν του μεθυλενίου είναι μια κατιονική φαινοθειαζινική χρωστική, της οποίας η δομή και οι ιδιότητες εξηγούν τη συγγένειά της με τις όξινες βακτηριακές επιφάνειες, την ίδια συγγένεια που δρα όταν καθιζάνει σε όξινες ζώνες στο EMB.

Σύγκριση με μια ματιά

Διαβάστε τον πίνακα ως διαδικασία λήψης απόφασης. Όταν η άσκηση απαιτεί από τους φοιτητές να δουν μια διαβάθμιση της ισχύος της ζύμωσης με ένα εντυπωσιακό τελικό αποτέλεσμα, το EMB την αναδεικνύει. Όταν η άσκηση απαιτεί έναν γρήγορο δυαδικό διαχωρισμό πριν από τη βιοχημική επιβεβαίωση, το MacConkey τον αναδεικνύει.

Ποιο μέσο για ποιο δείγμα

Για ασκήσεις με νερό που στοχεύουν στην τεκμαιρόμενη αναγνώριση κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών ή E. coli, το EMB είναι ελκυστικό επειδή η λάμψη είναι οπτικά χαρακτηριστική. Το MacConkey υποστηρίζει επίσης Gram-αρνητικούς εντερικούς οργανισμούς και έχει ιστορική χρήση σε αναλύσεις νερού, αλλά κανένα από τα δύο τρυβλία δεν υποκαθιστά μια κανονιστικά καθορισμένη μέθοδο ανάλυσης νερού, η οποία μπορεί να ορίζει μέσα όπως τροποποιημένο mTEC ή MI ανάλογα με τη δοκιμή. Ελέγξτε τη μέθοδο που υποχρεούται να ακολουθεί το εργαστήριό σας.

Για διαχωρισμούς τύπου κοπράνων μεταξύ ζυμωτών και μη ζυμωτών, το MacConkey είναι γενικά το χρησιμότερο από τα δύο. Η πρακτική εργαστηριακή εξέταση κοπράνων για Salmonella ή Shigella συνήθως περιλαμβάνει επιπλέον πιο εκλεκτικά εντερικά μέσα, όπως XLD ή Hektoen enteric, αντί να βασίζεται μόνο στο MacConkey.

Για εκπαιδευτικές ασκήσεις τύπου ούρων που μιμούνται την κλινική ροή εργασίας, συνδυάστε το MacConkey με αιματούχο άγαρ. Το MacConkey παρέχει τον αρχικό διαχωρισμό των Gram-αρνητικών, ενώ το αιματούχο άγαρ ανακτά οργανισμούς που καταστέλλονται από το MacConkey. Αυτός ο συνδυασμός αποτελεί συνήθη πρακτική στις κλινικές περιγραφές της προετοιμασίας καλλιέργειας ούρων.

Για καθαρά εννοιολογική διδασκαλία, χρησιμοποιήστε και τα δύο. Το EMB διδάσκει ότι η ένταση της ζύμωσης έχει σημασία και ότι ένα μόριο μπορεί να επιτελεί δύο ρόλους. Το MacConkey διδάσκει αρθρωτό σχεδιασμό: επιλογέας, υπόστρωμα και δείκτης παραμένουν ξεχωριστά. Οι φοιτητές που ενοφθαλμίζουν με γραμμώσεις ένα γνωστό E. coli, ένα γνωστό Klebsiella aerogenes και ένα γνωστό Salmonella δίπλα δίπλα και στα δύο μέσα σπάνια συγχέουν ξανά τις δύο λογικές.

Παγίδες ανάγνωσης που επαναλαμβάνονται κάθε εξάμηνο

Το συχνότερο σφάλμα είναι η ταυτοποίηση μόνο από το χρώμα. Το ροζ στο MacConkey μπορεί να είναι E. coli, Klebsiella, Enterobacter ή άλλος ζυμωτής. Το άχρωμο μπορεί να είναι Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ή άλλος μη ζυμωτής. Το χρώμα είναι ένας φαινότυπος διαλογής που κατευθύνει τις επιβεβαιωτικές διαδικασίες, όπως χρώση Gram, οξειδάση, βιοχημικά πάνελ ή ταυτοποίηση με όργανα, και όχι ονομασία είδους.

Το δεύτερο σφάλμα είναι η υπερερμηνεία της απουσίας λάμψης. Ορισμένες γνήσιες αποικίες E. coli, ιδιαίτερα οι απομονωμένες, παράγουν ελάχιστη ή καθόλου μεταλλική λάμψη στο EMB. Η απουσία λάμψης δεν αποκλείει το E. coli και η παρουσία λάμψης δεν το αποδεικνύει. Αντιμετωπίζετε τη λάμψη ως τεκμαιρόμενη ένδειξη.

Το τρίτο σφάλμα είναι η σύγκριση τρυβλίων διαφορετικής ηλικίας. Οι καθυστερημένοι ζυμωτές λακτόζης μπορούν να γίνουν ροζ στο MacConkey μετά από παρατεταμένη επώαση, γεγονός που θολώνει τον καθαρό διαχωρισμό μεταξύ ζυμωτών και μη ζυμωτών. Διαβάζετε το αποτέλεσμα την ώρα που καθορίζει το εργαστήριο και καταγράφετε τον χρόνο επώασης μαζί με το αποτέλεσμα.

Το τέταρτο σφάλμα είναι η ανάγνωση μικτής ανάπτυξης ως έναν οργανισμό. Μια ροζ αποικία δίπλα σε μια άχρωμη αποικία καταγράφει δύο φαινότυπους και όχι έναν ενδιάμεσο. Επιλέγετε καλά απομονωμένες αποικίες και εξετάζετε κάθε μορφότυπο ξεχωριστά. Η βλεννώδης υφή δημιουργεί παρόμοια παγίδα: τόσο το Klebsiella όσο και το Enterobacter μπορούν να φαίνονται βλεννώδη, επομένως η κάψα από μόνη της δεν καθορίζει ποτέ την ονομασία. Ο οργανισμός που παλαιότερα διδασκόταν ως Enterobacter aerogenes ταξινομείται πλέον ως Klebsiella aerogenes, γεγονός που εξηγεί γιατί παλαιότεροι πίνακες και νεότερες ετικέτες φαίνεται να διαφωνούν.

Μάρτυρες και ένας τελικός κανόνας

Χρησιμοποιείτε φωτογραφημένους ή φρέσκους μάρτυρες σε κάθε συνεδρία: E. coli για την αντίδραση ισχυρού ζυμωτή, Klebsiella aerogenes για βλεννώδη ζύμωση χωρίς την κλασική λάμψη, ένα στέλεχος Salmonella για την άχρωμη αντίδραση μη ζυμωτή και Staphylococcus aureus για να επιβεβαιώσετε την καταστολή Gram-θετικών στο συγκεκριμένο προϊόν σας. Αντιστοιχίζετε τους αριθμούς στελεχών και τα κριτήρια αποδοχής με το ένθετο του κατασκευαστή, επειδή η εκλεκτικότητα μεταβάλλεται ανάλογα με την περιεκτικότητα σε χολή, κρυσταλλικό ιώδες και χρωστικές.

Να θυμάστε μία πρόταση στον πάγκο εργασίας. Το EMB χρησιμοποιεί χρωστικές που ταυτόχρονα επιλέγουν και υποδεικνύουν, προσφέροντας ένα εντυπωσιακό σήμα E. coli με αντάλλαγμα μια πιο λεπτή ανάγνωση. Το MacConkey διαχωρίζει την επιλογή από την ένδειξη, προσφέροντας έναν απλό διαχωρισμό ροζ έναντι ωχρών αποικιών με αντάλλαγμα λιγότερες πληροφορίες για την ένταση της ζύμωσης. Επιλέξτε το μέσο του οποίου η αρχή ταιριάζει στο ερώτημα, επιβεβαιώστε το χρώμα με τις κατάλληλες δοκιμές και τα δύο τρυβλία παύουν να ανταγωνίζονται και αρχίζουν να λειτουργούν συμπληρωματικά.