Methylenblåt i forskning i slagtilfælde og cerebral hypoperfusion: hvad tre modeller faktisk viser

En blokeret arterie, en udsultet cellekultur og en rotte med forsnævrede halsarterier lyder som tre versioner af samme forsøg. Det er de ikke. Hvert forsøg stiller et forskelligt spørgsmål, og methylenblåt giver et forskelligt svar i hvert af dem. Blandes de sammen, virker litteraturen selvmodsigende. Holdes de adskilt, tegner der sig et tydeligt mønster, som hovedsageligt styres af tidspunktet.

Denne adskillelse er hele formålet med gennemgangen. De tre modeller er akut fokalt slagtilfælde, ilt- og glukosemangel med reoxygenering i dyrkede celler og kronisk cerebral hypoperfusion over flere uger. Den foreslåede mekanisme, der forbinder dem, er mitokondriel, men resultaterne er forskellige, fordi de metaboliske forhold er forskellige.

De tre modeller besvarer forskellige spørgsmål

Akut fokalt slagtilfælde hos rotter fremkaldes normalt ved at okkludere den midterste hjernearterie, forkortet MCAO. En blodproplignende blokering skaber en iskæmisk kerne omgivet af en penumbra, et væv, der er truet, men potentielt kan reddes, hvis blodgennemstrømningen vender tilbage. Spørgsmålet er her, om en intervention bremser infarktets vækst eller bevarer funktionen omkring reperfusionen.

Ilt- og glukosemangel, forkortet OGD, undersøges på en helt anden skala. Dyrkede hjerneceller placeres under forhold med næsten ingen ilt og uden glukose og føres derefter tilbage til normalt dyrkningsmedium. Der er ingen blodprop, intet kollateralt kredsløb, intet blodtryk og intet immunsystem. Spørgsmålet er rent cellulært: Hvad sker der med respiration, ATP og overlevelse, når substraterne forsvinder og derefter vender tilbage?

Ved kronisk cerebral hypoperfusion anvendes permanent bilateral okklusion af halspulsårerne hos rotter, kaldet 2VO-modellen. Blodgennemstrømningen til forhjernen falder og forbliver lav i flere uger. Der er intet pludseligt fokalt infarkt og ingen akut reperfusion. Spørgsmålet er, om flere ugers metabolisk støtte bevarer blodkar, mitokondrier og hukommelse under langvarig lav blodgennemstrømning.

En forbedring af hukommelsen efter en måneds behandling i 2VO-modellen siger derfor ikke noget direkte om at redde menneskelig hjernevæv under en akut trombektomi. Forskellen er vigtig, fordi de fleste optimistiske sammenfatninger springer den over.

Akut slagtilfælde: beskyttelse ved reperfusion, forsinkelse uden den

Det tydeligste akutte resultat kommer fra forbigående MCAO med reperfusion. Rotter blev udsat for 60 minutters okklusion og fik derefter methylenblåt intravenøst i lav dosis med start ved reperfusionen og yderligere doser efter 3 timer og på dag 2. MR viste, at læsionen i vehikelgruppen var vokset med omkring 19 procent på dag 2, mens læsionen i den behandlede gruppe var skrumpet med omkring 17 procent. De endelige infarkter var omtrent 30 procent mindre, og de neurologiske scorer var bedre på dag 2 og 7. Billeddiagnostikken viste forbedret overlevelse af væv i både kernen og penumbraen. Den bredere litteratur om neurobeskyttelse sætter denne beskyttelse ved reperfusion i sammenhæng med fund ved global iskæmi og traumer.

Billedet ændrer sig, når arterien forbliver blokeret. I et forsøg med permanent MCAO bremsede methylenblåt, givet under vedvarende iskæmi, udbredelsen af diffusionslæsionen og forlængede kortvarigt misforholdet mellem perfusion og diffusion med lidt bedre lokal blodgennemstrømning. Det endelige infarktvolumen efter 24 timer var dog ikke signifikant anderledes. Det forsinkede omdannelsen af truet væv til infarktvæv, men kunne ikke erstatte en genåbning af karret.

Et tredje akut studie tilføjer nuancer om mekanisme og dosis. En enkelt intraperitoneal dosis umiddelbart efter okklusionen gav den største reduktion af infarktet, omkring 50 procent, ved en mellemdosis på 5 mg/kg frem for ved 1 eller 10 mg/kg, samtidig med bedre sensorimotoriske scorer. Forfatterne knyttede dette til bevaret mitokondriestruktur og øget mitofagi, den selektive fjernelse af beskadigede mitokondrier. Dosis, administrationsvej og tidsplan har derfor betydning, og mg/kg-værdier fra rotter er ikke doser til mennesker med slagtilfælde.

Cellekultur: det samme lægemiddel hjælper eller skader afhængigt af, hvornår det tilføres

Astrocytforsøget er det mest lærerige og det, der oftest gengives forkert. Primære kortikale astrocytter fra mus blev udsat for 6 timers alvorlig mangel ved 0.1 procent ilt i et medium uden glukose, pyruvat eller serum, efterfulgt af 24 timers reoxygenering med genetableret tilførsel af substrater. Omkring halvdelen af cellerne døde, hvilket gav forsøget mulighed for at påvise en effekt i begge retninger.

Når methylenblåt var til stede under mangelfasen, blev overlevelsen dårligere, ikke bedre. Når det i stedet blev tilført ved reoxygeneringen, forbedrede lave mikromolære koncentrationer cellernes levedygtighed og øgede iltforbrug, glukoseoptagelse og ATP-produktion. Under normale forhold øgede de samme koncentrationer glukoseoptagelsen med omtrent 89 procent ved 0.1 micromolar og omkring 200 procent ved 1 micromolar, med bevaret glykogen og hexokinaseaktivitet efter skaden og uden nogen målt stigning i superoxid.

Mekanismen er lettere at forstå med en nødgenerator som analogi. Methylenblåt fungerer som en alternativ elektronbærer, der modtager reducerende ækvivalenter og fører dem videre mod cytokrom c og kompleks IV. Det understøtter elektronstrømmen og ATP-syntesen, samtidig med at elektronlækagen tidligere i kæden reduceres. Under alvorlig mangel er denne stimulering en ulempe, fordi den øger det metaboliske behov, når ilt og glukose næsten er fraværende, hvilket kan opbruge de sidste reserver hurtigere. Når substraterne vender tilbage, bliver den samme egenskab en fordel, fordi den hjælper beskadigede mitokondrier med effektivt at udnytte den genetablerede tilførsel af ilt og glukose. Derfor skal fund fra forklaringer af mitokondriel elektrontransport også ses i lyset af mangelforholdene.

Et forbehold: Denne regel om tidspunktet gælder for netop denne astrocytmodel. Et ledsagende cellestudie med en anden celletype, mildere mangel og en lavere koncentration fandt beskyttelse, selv når stoffet var til stede under mangelfasen. Celletype, resterende ilt, koncentration og forsøgsprotokol afgør, hvilken retning effekten tager.

Kronisk lav blodgennemstrømning: hukommelse, cytokromoxidase og blodkar over flere uger

De kroniske forsøg anvendte daglig behandling med lav dosis i flere uger, ikke en enkelt akut bolus. I det første studie fik rotter med permanent okklusion af halspulsårerne 4 mg/kg dagligt i en måned. Behandlingen blev givet efter hver daglig træningssession for at rette sig mod hukommelseskonsolidering frem for den umiddelbare præstation. Dyr med okklusion lærte visuelle skelneopgaver langsommere og klarede sig dårligere i en vanskelig hukommelsestest, mens svømmeevne, motorisk aktivitet og lugtgenkendelse var upåvirkede. Daglig behandling mindskede indlærings- og hukommelsesproblemerne uden at ændre den generelle motoriske adfærd.

Et opfølgende studie kortlagde cytokromoxidase, som er mitokondrielt kompleks IV, i 44 hjerneområder efter det samme behandlingsforløb på en måned. Okklusionen sænkede enzymaktiviteten i den visuelle, præfrontale og perirhinale cortex samt i hippocampus og amygdala og svækkede den koordinerede aktivitet mellem den visuelle cortex og hippocampus. Behandlingen bevarede den regionale enzymaktivitet og styrkede disse metaboliske korrelationer mellem områderne, og bevaret aktivitet korrelerede med bedre opgavepræstation. Disse korrelationer beskriver koordineret metabolisk enzymaktivitet, ikke direkte mål for funktionel konnektivitet hos mennesker. Det er en skelnen, som gennemgange af hjernens energistofskifte hjælper med at fastholde.

Et separat studie over en uge anvendte 2 mg/kg dagligt og tilføjede en hæmmer af en signalvej for at undersøge mekanismen. Den cerebrale blodgennemstrømning steg med behandlingen fra omkring 60 til omkring 100 mL pr. 100 g pr. minut, og kartætheden i hippocampus steg fra omkring 15.1 til 23 procent. Begge forbedringer blev delvist ophævet, når PI3K/Akt-overlevelsessignalvejen blev blokeret, og fosforyleret Akt steg med behandlingen. Fundene vedrørende blodgennemstrømning, kartæthed, barriere og neuroner peger på neurovaskulær beskyttelse knyttet til PI3K/Akt-signalering snarere end en rent metabolisk effekt.

Hvorfor intet af dette svarer til akut behandling af slagtilfælde

De kontrollerede laboratorieforhold er grunden til, at disse resultater ikke kan overføres direkte. Dyrkede celler har ingen trombe eller farmakokinetik. 2VO-modellen er langvarig global lav blodgennemstrømning, ikke en pludselig fokal embolus med en penumbra, der kun er få minutter gammel. Selv MCAO hos rotter anvender unge, raske dyr, bedøvelse, ensartede okklusioner og præcist tidsbestemt dosering, i modsætning til ældre patienter med forskellige blodpropper, åreforkalkning, hypertension, diabetes og ukendt tidspunkt for symptomdebut.

Intet offentliggjort randomiseret forsøg på mennesker har fastslået methylenblåt som akut behandling af akut iskæmisk slagtilfælde. Et billeddiagnostisk studie på mennesker, som undertiden citeres, omfattede 26 raske voksne, ikke patienter med slagtilfælde, og en enkelt oral dosis ændrede opgaverelaterede hjernesignaler med en lille forbedring af hukommelsesgenkaldelsen. Det viser aktivitet i centralnervesystemet, ikke effekt ved slagtilfælde. De gældende retningslinjer for akut behandling fokuserer i stedet på hurtig reperfusion med intravenøs trombolyse hos egnede patienter og trombektomi ved relevante okklusioner af store kar, og de almindelige akutte behandlingsforløb for slagtilfælde er fortsat den eneste dokumenterede vej. Behandling ved mistanke om slagtilfælde må aldrig forsinkes for at give methylenblåt, og de praktiske begrænsninger ved at ekstrapolere præklinisk dosering forklarer, hvorfor tidsplaner fra rotteforsøg ikke kan læses som kliniske behandlingsregimer.

Sikkerhedsforholdene understreger denne grænse. Intravenøst methylenblåt har en fremhævet advarsel i en ramme om alvorligt eller dødeligt serotoninsyndrom ved kombination med serotonerge lægemidler, herunder SSRI'er, SNRI'er og MAO-hæmmere, som mange patienter i den aldersgruppe, hvor slagtilfælde forekommer, tager. Det er kontraindiceret ved G6PD-mangel på grund af risikoen for hæmolyse. Det hæmmer også nitrogenmonoxid-signalering, hvilket i visse situationer øger karmodstand og blodtryk, så det bør ikke blot beskrives som et lægemiddel, der øger hjernens blodgennemstrømning. Det godkendte intravenøse regime på 1 mg/kg ved erhvervet methæmoglobinæmi er ikke et behandlingsregime for slagtilfælde.

Den ærlige konklusion er snæver, men reel. Omkring reperfusion ved forbigående fokal iskæmi reducerede methylenblåt i lav dosis læsionens udvikling hos rotter. Ved permanent okklusion forsinkede det infarktdannelsen, men forhindrede den ikke. I astrocytter skadede det under alvorlig mangel og hjalp ved reoxygenering. Under kronisk hypoperfusion bevarede det cytokromoxidase, blodkar og hukommelse over flere uger. Én elektrontransportør, tre sammenhænge, tre svar.