Betyder større iltforbrug mere ATP? Erfaringer fra studier af methylenblåt

Et isoleret mitokondrie befinder sig i et kammer med brændstof, men uden ADP. Det forbruger langsomt ilt. Tilsæt ADP, og iltforbruget stiger flere gange. Vent, til ADP er opbrugt, og iltforbruget falder igen. Brændstoffet ændrede sig aldrig. Det gjorde kun behovet for ATP.

Dette lille forløb rummer hele den skelnen, som artiklen handler om. Iltforbrug måler, hvor hurtigt elektroner strømmer gennem respirationskæden til ilt. ATP-produktion måler, hvor meget af denne strøm der indfanges som brugbar energi. De to deler et mellemtrin, nemlig protongradienten over den indre mitokondriemembran, og alt, der ændrer, hvor tæt gradienten er koblet til ATP-syntesen, kan flytte de to slutpunkter i forskellige retninger. Methylenblåt er et nyttigt eksempel her, fordi det er blevet observeret at gøre begge dele: øge iltforbruget sammen med ATP i nogle præparater og øge iltforbruget, mens ATP forbliver uændret eller falder, i andre.

Læsere, der først ønsker det bredere billede af elektronoverførslen, kan begynde med, hvordan methylenblåt transporterer elektroner gennem respirationskæden, og læsere, der ønsker at forstå begreberne fra de tidlige iltforsøg, kan læse om, hvad de første respirationsmålinger faktisk viste.

Respiration, ATP og gradienten mellem dem

Elektroner fra NADH og FADH2 træder ind i kæden ved kompleks I og II, passerer gennem kompleks III til cytokrom c og derefter gennem kompleks IV til ilt. Den energi, der frigives ved kompleks I, III og IV, pumper protoner ud af matrix og ind i intermembranrummet. Denne adskillelse af ladning og surhedsgrad udgør den protonmotoriske kraft, og dens elektriske del, membranpotentialet, er normalt den dominerende del.

ATP-syntase lader protoner strømme tilbage til matrix og bruger den frigivne energi til at forbinde ADP og fosfat til ATP. Forløbet er altså:

iltforbrug, derefter protonpumpning, derefter gradient, derefter ATP-syntese.

Problemet er, at protoner kan vende tilbage ad andre veje. Enhver tilbagevenden, der går uden om ATP-syntase, er protonlækage. Lækage tvinger kæden til at pumpe de samme protoner igen for at holde membranpotentialet stabilt, hvilket forbruger mere ilt uden at danne mere ATP. En tilstrækkeligt kraftig lækage er afkobling: Iltforbruget stiger, mens ATP forbliver uændret eller falder, og den spildte energi afgives som varme.

Tilstand 3, tilstand 4 og den respiratoriske kontrolratio

De klassiske begreber for dette stammer fra isolerede mitokondrier. Tilstand 3 er respiration med både substrat og ADP til stede: ATP-syntase reducerer gradienten, membranpotentialet falder, kæden accelererer for at genopbygge det, og iltforbruget er højt, fordi der dannes ATP. Tilstand 4 er respiration, efter at ADP er opbrugt: ATP-syntase kører i tomgang, gradienten stiger, det høje membranpotentiale modvirker yderligere pumpning, og iltforbruget falder til det niveau, der er nødvendigt for at kompensere for lækage.

Den respiratoriske kontrolratio, tilstand 3 divideret med tilstand 4, viser derfor, hvor tæt præparatet er koblet. En høj ratio betyder, at ADP i høj grad styrer respirationen. En faldende ratio med stigende tilstand 4 betyder, at lækage er ved at tage over. Det er gennem denne forståelsesramme, at resultaterne med methylenblåt nedenfor giver mening.

Én tankemodel er værd at holde fast i. Et højt membranpotentiale bremser kæden. Når potentialet reduceres, accelererer den. Kæden reagerer på, hvor svært det er blevet at pumpe, ikke direkte på, om der dannes ATP.

Når slutpunkterne følges ad

Det tydeligste eksempel på kobling kommer fra isolerede mitokondrier fra marsvinehjerner med blokerede respirationskomplekser. Ved 100 nanomolar til 1 micromolar methylenblåt steg iltforbruget i hvile med glutamat plus malat, succinat eller glycerofosfat som brændstof, mens den ADP-stimulerede respiration var uændret. I mitokondrier, hvor kompleks I eller kompleks III var hæmmet med et giftstof, øgede farvestoffet ATP-produktionen beskedent, genoprettede membranpotentialet og forbedrede calciumoptagelsen. Den foreslåede vej er en genvej: Farvestoffet modtager elektroner før blokeringen og afleverer dem til cytokrom c, så det beskadigede kompleks omgås.

Et andet tilfælde af kobling bruger en helt anden ATP-kilde. I isolerede hjernemitokondrier med hæmmet ATP-syntase stimulerede methylenblåt stadig respirationen med alle de testede substrater. Men ATP-syntesen steg kun med alfa-ketoglutarat og glutamat, de to substrater, der danner succinyl-CoA. Når oligomycin blokerede ATP-syntase, kom det ekstra ATP fra fosforylering på substratniveau via succinyl-CoA-ligase i citronsyrecyklussen, ikke fra oxidativ fosforylering. Farvestoffet genoprettede også membranpotentialet, når kompleks I og ATP-syntase blev hæmmet samtidig. Her fulgtes iltforbrug og ATP ad, men kun hvor substratet muliggjorde den anden ATP-vej. Med succinat eller malat steg respirationen uden ekstra ATP. Samme farvestof, samme kammer, forskelligt brændstof, forskelligt svar.

Når slutpunkterne går hver sin vej

Tilfældene, hvor slutpunkterne går hver sin vej, er lige så veldokumenterede og lige så lærerige. I et studie af isolerede mitokondrier fra rottelever fra 1997 accelererede methylenblåt respirationen i tilstand 4 i tæt koblede mitokondrier, der respirerede med succinat, hvilket sænkede den respiratoriske kontrolratio. Effekten var synlig fra 0.5 micromolar og kraftig ved 5 micromolar, en koncentration tæt på plasmaniveauerne efter en intravenøs bolus på 100 milligram. Ved 5 micromolar svulmede mitokondrierne også op, men koblingsdefekten viste sig først ved lavere koncentrationer, hvilket taler for, at lækagen kom før den strukturelle skade og ikke som følge af den. I afkoblede mitokondrier stimulerede farvestoffet respirationen på en mætbar, koncentrationsafhængig måde. Iltforbruget steg i begge præparater. ATP-syntesen pr. forbrugt ilt gjorde ikke. Det er et skoleeksempel på afkobling kombineret med elektrontransport i det samme molekyle.

Den mest markante adskillelse kommer fra nethinden. Hos mus med AIF-mangel og i rotenonbehandlede fotoreceptorceller bevarede methylenblåt nethindens tykkelse, fotoreceptormarkører og mitokondriernes struktur, og det sænkede forholdet mellem NADH og NAD og dæmpede stresssignalveje, herunder responsen på udfoldede proteiner og mitofagi. Det gjorde det uden at afhjælpe ATP-underskuddet. Beskyttelse uden genoprettet energi betyder, at fordelen gik gennem redoxbalancen og mitokondriernes integritet, ikke gennem ekstra ATP. Enhver, der sidestiller vævets overlevelse med genoprettet energiproduktion, ville fejlfortolke dette forsøg fuldstændigt.

Arbejdet med hjernemitokondrier tilføjer en omkostningskolonne til det samme regnskab. De samme lave koncentrationer, som forbedrede bioenergetikken, øgede også dannelsen af hydrogenperoxid under alle testede betingelser og bremsede dets eliminering, målt med et kalibreret Amplex-assay frem for et uspecifikt farvestof. Mere ATP og mere oxidant fulgtes ad.

En praktisk læsetjekliste

Fire spørgsmål adskiller et koblet resultat fra et afkoblet.

For det første: Hvilket slutpunkt blev faktisk målt? Iltforbrug alene kan ikke fortælle noget om ATP. ATP-syntese, membranpotentiale og den respiratoriske kontrolratio tilføjer hver en brik, som iltelektroden ikke kan se. Vejledningen til at læse forskningspåstande om methylenblåt gennemgår denne disciplin i vurderingen af slutpunkter i detaljer.

For det andet: Hvilket substrat forsynede mitokondrierne? Resultatet med succinyl-CoA viser, at valget af brændstof kan afgøre, om ekstra respiration overhovedet kan blive til ekstra ATP.

For det tredje: Hvilken koncentration blev brugt? Methylenblåt i nanomolare til lave micromolare koncentrationer i hjernemitokondrier gav beskedne bioenergetiske forbedringer med en oxidantrelateret omkostning; en halv micromolar og derover i levermitokondrier svækkede koblingen; 5 micromolar medførte også opsvulmning. Koncentrationen er en del af mekanismen, ikke en baggrundsdetalje.

For det fjerde: Hvilken model lå til grund for resultatet? Isolerede mitokondrier afslører de indre forbindelser, men intakte celler og væv tilføjer transport, reduktion til den farveløse form og konkurrerende aftagere af elektroner. Arbejde med dosering i laboratoriet, herunder hvordan koncentration og forsøgsprotokol former virkningerne af methylenblåt, er broen mellem tallene fra kammeret og enhver påstand om et menneske.

Iltforbrug viser elektronstrøm. ATP viser, hvor meget af denne strøm der blev indfanget. Methylenblåt kan ændre begge dele, og forsøgene ovenfor viser alle fire kombinationer, der følger: Begge stiger, respirationen stiger kun dér, hvor substratet tillader det, respirationen stiger, mens koblingen svækkes, og vævet bevares, mens ATP forbliver uændret. Tallet på iltelektroden er begyndelsen på fortolkningen, ikke slutningen.