Methylenblåt og Bartonella: laboratoriefund og grænserne for klinisk evidens

En dyrkningsskål og en patient har et ord til fælles, infektion, men ikke det samme begreb. I skålen er infektion et antal kolonier på agar. Hos patienten er det bakterier inde i celler og blodkar, lægemidler, der bevæger sig gennem blod og væv, og et immunsystem, der udfører en del af arbejdet. Bland de to sammen, og et slående laboratorietal begynder at ligne en behandling. Hold dem adskilt, og det samme tal bliver, hvad det er: en grund til at udføre det næste eksperiment.

Denne adskillelse er hele formålet med denne gennemgang af methylenblåt og Bartonella. To laboratoriestudier fra én forskergruppe afprøvede methylenblåt mod Bartonella henselae i ikke-voksende tilstande. Begge rapporterede stærk aktivitet i glas og plast. Ingen af dem undersøgte et menneske.

Hvorfor forskere undersøger den stationære fase

De fleste antibiotikatests bruger voksende celler. Den model overser et vanskeligere tilfælde: celler, der er holdt op med at dele sig og tåler lægemidler, som dræber deres voksende søsterceller.

Bartonella kan persistere i kroppen, blandt andet inde i erytrocytter og endotelceller. Gruppen undersøgte derfor, hvilke godkendte lægemidler der kan dræbe B. henselae, efter at den er gået ind i den stationære fase. En lav MIC mod voksende celler forudsagde ikke drab på celler i stationær fase. Rifampicin havde en meget lav MIC, men dræbte stationære celler dårligt, mens stoffer med højere MIC-værdier dræbte dem effektivt. Læsere, der ønsker en generel metode til at læse denne type artikel, finder den i vejledningen til at læse forskning i methylenblåt.

Første screening: Li og kolleger, 2019

Screeningen af stationær fase fra 2019 i Antibiotics brugte en enkelt stamme, B. henselae JK53, dyrket i Schneider-medium med 10 procent føtalt bovint serum ved 37 C med 5 procent CO2. Én dag gamle kulturer bestod hovedsageligt af spredte celler i deling. Fem dage gamle kulturer med omkring 10 i 8. potens kolonidannende enheder per mL blev betragtet som værende i stationær fase og indeholdt synlige aggregater.

Analysen anvendte SYBR Green I med propidiumiodid, kalibreret mod blandinger af levende celler og celler dræbt med isopropanol. Fordi methylenblåt er kraftigt farvet, blev positive fund bekræftet ved mikroskopi og derefter ved kolonitælling på blodagar, det strengere endepunkt.

Blandt 1,581 godkendte lægemidler ved 50 mikromolar efterlod methylenblåt 16 procent levedygtighed målt med pladelæser og 25 procent målt ved mikroskopi. Daptomycin gav 21 procent, flere azoler gav 22 til 27 procent, gentamicin 32 procent, erythromycin 66 procent og ciprofloxacin 74 procent. Pyrviniumpamoat så stærkere ud på pladelæseren, men kunne ikke vurderes ved mikroskopi på grund af sin egen fluorescens.

Mod voksende B. henselae var MIC for methylenblåt 0.08 til 0.16 mikrogram per mL. Mod fem dage gamle stationære celler ved 5 mikrogram per mL faldt kolonitallet til ingen påviselige kolonier efter én dags eksponering, svarende til daptomycin og pyrviniumpamoat ved de afprøvede koncentrationer. Et særskilt tidsafhængigt drabsforsøg anvendte 10 mikrogram per mL. Det er eksponeringsniveauer i laboratoriet, ikke doser, og artiklen beskriver dem som sådanne. En citeret maksimal plasmakoncentration hos mennesker på omkring 3.9 mikrogram per mL optræder kun i artiklen som baggrundsinformation. Oversigten over methylenblåts farmakokinetik forklarer, hvorfor et plasmatal ikke kan læses som et vævstal.

To begrænsninger er udtrykkeligt angivet i artiklen. Der var ingen biofilmmodel og ingen test af kombinationer med methylenblåt. De fem dage gamle aggregater var celleklynger i en stationær væskekultur, ikke et valideret biofilmforsøg. Forfatterne efterlyste dyreforsøg, kombinationsforsøg, biofilmforsøg og test i andre Bartonella-arter.

Kombinationer og celler fra biofilm: Zheng og kolleger, 2020

Opfølgningsstudiet fra 2020 i BMC Microbiology beholdt samme stamme og medium, men gik over til seks dage gamle stationære kulturer og tilføjede to ting, som den første artikel manglede: kombinationer af to lægemidler og en model med celler fra biofilm.

Ved test af enkelte lægemidler ved ensartede 5 mikrogram per mL i 24 timer efterlod methylenblåt 3.2 gange 10 i 4. potens kolonidannende enheder per mL sammenlignet med en kontrol på omkring 2.8 gange 10 i 10. potens. Ciprofloxacin, gentamicin og nitrofurantoin efterlod færre kolonier på samme tidspunkt. Det adskiller sig fra resultatet fra 2019, hvor samme nominelle niveau gav ingen påviselige kolonier efter én dag. Kulturernes alder, tæthed og håndtering var forskellige, så den dræbende aktivitet var reproducerbar i sin retning, men ikke identisk i sit omfang. Denne variation fra forsøg til forsøg er en af grundene til, at almindelige sikkerheds- og interaktionsvurderinger behandler styrken af laboratorieaktivitet adskilt fra klinisk effekt.

Kombinationsscreeningen er den mest citerede del. Hver komponent blev fastholdt ved 5 mikrogram per mL. Både azithromycin plus methylenblåt og rifampicin plus methylenblåt gav ingen påviselige kolonier fra stationær fase efter 24 timer, ligesom begge ciprofloxacin-kombinationer gjorde. Kun disse fire blandt 25 afprøvede kombinationer gav dette resultat. Der blev ikke udført nogen formel synergianalyse, så den korrekte betegnelse er en aktiv kombination under disse betingelser, ikke dokumenteret synergi.

Biofilmforsøget undersøgte celler udvundet fra en ung, opbrudt biofilm, ikke indtrængning i en intakt, moden biofilm. Kulturer blev dyrket i fem dage, fortyndet i brøndplader i yderligere fem dage, bekræftet ved krystalvioletfarvning og derefter skrabet af før eksponering for lægemidler. Ved 5 mikrogram per mL reducerede methylenblåt alene antallet til 2.3 gange 10 i 2. potens på dag 6, blandt de bedste enkeltmidler, men ikke til nul. Begge kombinationer med methylenblåt nåede nul på dag 6, ligesom begge kombinationer med ciprofloxacin.

Forfatterne fremhævede de samme begrænsninger, som en omhyggelig læser ville bemærke: ung, afskrabet biofilm frem for gammel, intakt biofilm; én praktisk koncentration for alle lægemidler frem for hvert lægemiddel ved sin egen realistiske maksimale koncentration; kun udvalgte kombinationer med azithromycin eller rifampicin som udgangspunkt; én stamme; ingen dyr; ingen patienter. Senere arbejde med tre lægemidler blev foreslået, ikke rapporteret.

Sammenligning af studiedesign

Tabellen sammenfatter artiklens pointe. Alt til venstre for den sidste kolonne er arbejde med kulturer. Intet i nogen af artiklerne hører hjemme i den sidste kolonne.

Bartonella er ikke Borrelia

Begge artikler nævner Borrelia burgdorferi, spirokæten, der forårsager Lyme-borreliose, fordi farvestofanalysen stammer fra tidligere arbejde med Borrelia i stationær fase i samme laboratorium, hvor methylenblåt og daptomycin også havde vist aktivitet. Den baggrund er nyttig kontekst og en almindelig kilde til fejl.

Intet forsøg i nogen af Bartonella-artiklerne tester Borrelia side om side med Bartonella. Organismerne er forskellige, medierne er forskellige, koncentrationerne er forskellige, og den formodede membranpåvirkning fra methylenblåt hos Bartonella blev beskrevet som en spekulation, der kræver flere undersøgelser. Resultater bør ikke overføres mellem arter, og ingen af artiklerne understøtter brede påstande om parasitter. Sammenligningen af persisterceller hos Borrelia og Bartonella holder af denne grund de to forskningsområder adskilt.

Hvorfor kulturer ikke kan omsættes til en protokol

Interessen for at søge efter en protokol med methylenblåt mod Bartonella er forståelig. Disse artikler er grunden til, at den formulering bør betragtes som et advarselssignal snarere end en indkøbsliste.

For det første er 5 mikrogram per mL i en brønd ikke en ordination. Tallet siger intet om absorption, fordeling, proteinbinding, indtrængning i celler eller tolerabilitet. Forfatterne valgte det som et groft gennemsnit af antibiotikas maksimale koncentrationer og sagde, at fremtidige forsøg burde bruge hvert lægemiddel ved dets eget realistiske niveau.

For det andet betyder nul kolonier, at der ikke er kolonier under de pågældende udpladningsbetingelser, ikke at vævet er sterilt. Persisterceller, intracellulære bakterier og begrænsninger ved prøvetagning ligger alle uden for agarpladen.

For det tredje kan kombinationer, der steriliserer en brønd, svigte eller gøre skade i en krop. Azithromycin plus methylenblåt og rifampicin plus methylenblåt er laboratoriekombinationer ved eksponeringer i laboratoriet. Uden farmakokinetiske data fra dyr og kontrollerede data fra mennesker findes der ingen dosis, ingen varighed og intet forhold mellem gavn og risiko. Enhver, der overvejer mulighederne, bør drøfte dem med en læge og gennemgå, hvornår brug af methylenblåt kræver lægeligt tilsyn, før der drages konklusioner ud fra data fra dyrkningsskåle.

Den snævre konklusion, som disse artikler faktisk understøtter, er denne: Methylenblåt har reproducerbar aktivitet mod ikke-voksende B. henselae JK53 in vitro, også i laboratoriekombinationer med to lægemidler, og de stærkeste resultater for kombinationer og celler fra biofilm kommer fra studiet fra 2020. Alt andet, herunder om denne aktivitet har betydning for bartonellose hos mennesker, er fortsat uafprøvet.