EMB-agar versus MacConkey-agar: valg og fortolkning af medier

En studerende udstryger den samme vandprøve på to plader. På den ene fremkommer mørke kolonier med en grøn metallisk glans. På den anden fremkommer klart lyserøde kolonier med en diffus halo. Begge plader blev inokuleret fra det samme rør, inkuberet side om side og aflæst på samme tidspunkt. Den studerende spørger, hvilken plade der er rigtig.

Begge plader er rigtige. De besvarer forskellige spørgsmål. Forvirringen opstår, når de to medier behandles som indbyrdes udskiftelige screeningsmedier for tarmbakterier. De har et fælles formål, nemlig at selektere gramnegative enteriske organismer og skelne laktosefermenterende organismer fra ikke-fermenterende organismer, men de opfylder dette formål med forskellig kemi og forskellig visuel logik. Når først de to underliggende koncepter er forstået, bliver valg af plade og aflæsning af kolonier rutine.

Det korte svar

EMB-agar anvender to farvestoffer, eosin Y og methylenblåt, som udfører to funktioner samtidig: De hæmmer væksten af grampositive organismer og udfældes omkring kraftige syreproducenter, så der dannes mørke kolonier, klassisk med en metallisk grøn glans for Escherichia coli. MacConkey-agar adskiller funktionerne: Galdesalte plus krystalviolet hæmmer grampositive organismer, laktose fungerer som substrat for fermentering, og neutralrødt viser syredannelse som lyserøde eller røde kolonier. Hvis opgaven er en tydelig formodet påvisning af E. coli, har EMB sin berettigelse. Hvis opgaven er en enkel sortering af laktosefermenterende organismer fra ikke-fermenterende organismer som lyserøde versus farveløse kolonier, især i arbejdsgange med fæces- eller urinprøver, er MacConkey som regel enklere at aflæse. Ingen af pladerne identificerer en organisme alene ud fra farven.

EMB: farvestoffer, der både selekterer og indikerer

EMB-konceptet samler selektion og indikation i de samme molekyler. ASM-protokollen for eosin-methylenblåt-agar beskriver EMB som både selektivt og differentierende, hvor farvestofparret hæmmer mange grampositive organismer, mens laktosefermentering fremmer optagelse og udfældning af farvestofferne. En standardformulering efter Levine indeholder pepton, laktose, fosfat, eosin Y, methylenblåt og agar, som angivet i FDA BAM-metoden for Levine EMB-agar. Bemærk, at ældre EMB-opskrifter undertiden tilsatte sukrose sammen med laktose, mens Levine EMB indeholder laktose uden sukrose, så registrer, hvilken formulering laboratoriet har på lager.

Aflæsning af EMB betyder aflæsning af farvestoffernes adfærd. Kraftig laktosefermentering producerer tilstrækkeligt med syre til at fremkalde omfattende udfældning af farvestof, hvilket giver E. coli mørkeblå-sorte centre og i det klassiske tilfælde en grøn metallisk glans i reflekteret lys. Svagere fermenterende organismer som Enterobacter og Klebsiella vokser typisk som lyserøde til lilla, mukøse kolonier uden denne glans. Ikke-fermenterende organismer som Salmonella, Shigella og Proteus vokser generelt som farveløse eller gennemskinnelige kolonier, fordi de ikke producerer den kraftige syredannelse, som udfælder farvestofferne. Grampositive organismer hæmmes normalt, men hæmningsgraden varierer afhængigt af stamme og produkt. Den fulde kemi bag fremstillingen af farvestofferne, herunder hvorfor methylenblåt overhovedet opfører sig som et kationisk farvestof, hører hjemme i en separat gennemgang af farvestofformuleringer, mens den generelle mikroskopikontekst findes i et atlas over farvningsmetoder. Denne artikel fokuserer på valg og aflæsning af plader.

Figuren ovenfor er illustrativ. Den viser den visuelle logik, man kan forvente: mørke kolonier med glans plus lyserøde mukøse typer plus lyse typer på EMB sammenholdt med lyserøde versus lyse typer på MacConkey. Brug den til at lære mønstret, og bekræft derefter hver vurdering ved hjælp af fotograferede kontroller og produktindlægget for det præcise medie på laboratoriebænken.

MacConkey: adskilte funktioner, enklere visuel regel

MacConkey-konceptet tildeler hver funktion til en separat ingrediens. ASM-protokollen for MacConkey-agar anvender den samme selektive og differentierende tilgang, og FDA BAM-metoden for MacConkey-agar angiver de funktionelle bestanddele: peptoner, laktose, galdesalte, salt, neutralrødt, krystalviolet og agar. Galdesalte plus krystalviolet selekterer mod grampositive organismer. Laktose leverer substratet til fermentering. Neutralrødt fungerer som pH-indikator og bliver lyserødt til rødt, hvor der dannes syre, undertiden med udfældet galde omkring kraftigt fermenterende organismer.

Aflæsningsreglen er bevidst enkel: Lyserød betyder laktosefermenterende, mens farveløs eller lys betyder ikke-fermenterende. E. coli fremstår lyserød til rød, ofte med en halo af galdeudfældning. Klebsiella og Enterobacter fremstår lyserøde og ofte mukøse på grund af deres kapsler. Salmonella, Shigella, Proteus og mange andre gramnegative stave fremstår farveløse. En ekstra fordel er relevant i undervisningslaboratorier: Galdesalte reducerer generelt Proteus-sværmning, så isolerede kolonier er lettere at opnå på MacConkey end på ikke-selektive medier, selv om hæmningen ikke er absolut, og der findes saltfrie alternativer, når kontrol af sværmning har højeste prioritet.

Den molekylære årsag til, at farvestofferne opfører sig på denne måde, skyldes ladning og struktur. Methylenblåt er et kationisk phenothiazinfarvestof, hvis struktur og egenskaber forklarer dets affinitet for sure bakterieoverflader, hvilket er den samme affinitet, der er i spil, når det udfældes i sure zoner på EMB.

Sammenligning i korte træk

Læs tabellen som en beslutningsprocedure. Når øvelsen kræver, at de studerende ser en gradient i fermenteringsstyrke med ét markant slutpunkt, viser EMB det. Når øvelsen kræver en hurtig binær sortering før biokemisk bekræftelse, viser MacConkey det.

Hvilket medie til hvilken prøve

Til vandøvelser, der sigter mod formodet genkendelse af fækale coliforme bakterier eller E. coli, er EMB attraktivt, fordi glansen er visuelt karakteristisk. MacConkey håndterer også enteriske gramnegative organismer og har historisk været anvendt til vandprøver, men ingen af pladerne erstatter en regulatorisk vandanalysemetode, som afhængigt af testen kan foreskrive medier som modificeret mTEC eller MI. Kontrollér den metode, laboratoriet er forpligtet til at følge.

Til fæceslignende separationer af fermenterende fra ikke-fermenterende organismer er MacConkey generelt det mest anvendelige af de to. Praktisk arbejde med fæcesprøver for Salmonella eller Shigella omfatter normalt mere selektive enteriske medier som XLD eller Hektoen enteric frem for udelukkende at basere sig på MacConkey.

Til undervisning med urinprøver, der efterligner kliniske arbejdsgange, kombineres MacConkey med blodagar. MacConkey giver den tidlige sortering af gramnegative organismer, mens blodagar giver vækst af organismer, som MacConkey hæmmer. Denne kombination er standard i kliniske beskrivelser af opsætning af urindyrkning.

Til ren konceptundervisning kan begge anvendes. EMB lærer, at fermenteringsstyrke har betydning, og at ét molekyle kan udføre to funktioner. MacConkey lærer modulært design: selektor, substrat og indikator holdes adskilt. Studerende, der udstryger en kendt E. coli, en kendt Klebsiella aerogenes og en kendt Salmonella side om side på begge medier, forveksler sjældent de to principper igen.

Faldgruber ved aflæsning, der går igen hvert semester

Den mest almindelige fejl er identifikation alene ud fra farven. Lyserød på MacConkey kan være E. coli, Klebsiella, Enterobacter eller en anden fermenterende organisme. Farveløs kan være Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas eller en anden ikke-fermenterende organisme. Farven er en screeningsfænotype, der styrer det videre bekræftende arbejde såsom gramfarvning, oxidase, biokemiske paneler eller instrumentbaseret identifikation, ikke et artsnavn.

Den anden fejl er at overfortolke manglende glans. Nogle reelle E. coli-kolonier, især isolerede kolonier, producerer kun lidt eller ingen metallisk glans på EMB. Manglende glans udelukker ikke E. coli, og tilstedeværelse af glans beviser det ikke. Betragt glansen som en formodet indikator.

Den tredje fejl er at sammenligne plader med forskellig alder. Forsinket laktosefermenterende organismer kan blive lyserøde på MacConkey efter længere tids inkubation, hvilket udvisker den tydelige opdeling mellem fermenterende og ikke-fermenterende organismer. Aflæs på det tidspunkt, laboratoriet har angivet, og registrer inkubationstiden sammen med resultatet.

Den fjerde fejl er at aflæse blandet vækst som én organisme. En lyserød koloni ved siden af en farveløs koloni repræsenterer to fænotyper, ikke en mellemform. Udtag velisolerede kolonier, og arbejd med hver morfotype separat. Mukøs tekstur skaber en lignende faldgrube: Både Klebsiella og Enterobacter kan se mukøse ud, så kapslen alene afgør aldrig navnet. Den organisme, der tidligere blev undervist som Enterobacter aerogenes, klassificeres nu som Klebsiella aerogenes, hvilket forklarer, hvorfor ældre oversigter og nyere etiketter kan se ud til at være uenige.

Kontroller og en afsluttende regel

Kør fotograferede eller friske kontroller ved hver session: E. coli for reaktionen hos en kraftigt fermenterende organisme, Klebsiella aerogenes for mukøs fermentering uden den klassiske glans, en Salmonella-stamme for den farveløse reaktion hos en ikke-fermenterende organisme og Staphylococcus aureus for at bekræfte hæmning af grampositive organismer på det præcise produkt. Tilpas stammenumre og acceptkriterier til producentens produktindlæg, fordi selektiviteten ændrer sig med indholdet af galde, krystalviolet og farvestoffer.

Husk én sætning ved laboratoriebænken. EMB bruger farvestoffer, der både selekterer og signalerer, hvilket giver et markant E. coli-signal på bekostning af en mere nuanceret aflæsning. MacConkey adskiller selektion fra signalering, hvilket giver en enkel sortering mellem lyserød og lys på bekostning af færre detaljer om fermenteringen. Vælg det medie, hvis koncept passer til spørgsmålet, bekræft farven med de relevante tests, så holder de to plader op med at konkurrere og begynder at supplere hinanden.