Staenio syml â glas methylen o'i gymharu â staenio Gram: beth y gall pob dull ei brofi

Mae myfyriwr yn paratoi taeniad o feithriniad wedi'i labelu'n E. coli, yn ei orchuddio â glas methylen am un munud, yn ei rinsio, ac yn edrych drwy'r lens olew. Mae celloedd siâp gwialen glas yn llenwi'r maes. Mae adroddiad y labordy yn dweud: "Basilau Gram-negyddol wedi'u hadnabod fel E. coli." Mae'r arsylwad yn gywir. Nid yw'r sleid honno'n cyfiawnhau'r casgliad.

Gwall cysyniadol yw hwn, nid gwall technegol. Roedd y myfyriwr yn trin staen syml fel pe bai'n brawf gwahaniaethol. Mae staen syml a staen Gram yn ateb cwestiynau gwahanol oherwydd eu bod yn ymgorffori cysyniadau staenio gwahanol. Mae un yn gofyn: pa siâp sy'n bresennol. Mae'r llall yn gofyn: sut mae'r cellfur yn ymddwyn pan gaiff ei herio. Os cymysgwch y ddau, bydd sleid sydd wedi'i staenio'n gywir yn arwain at adroddiad nad oes modd ei gyfiawnhau.

Mae'r gymhariaeth hon yn cadw'r ddau ddull ar wahân, yn dangos pa honiadau y mae pob canlyniad yn eu cyfiawnhau, ac yn ateb y ddau gwestiwn y mae myfyrwyr yn eu gofyn amlaf: a ellir defnyddio glas methylen mewn staenio Gram, a beth y mae staen glas methylen o E. coli yn ei ddangos mewn gwirionedd.

Yr ateb byr

Mae staenio syml â glas methylen yn lliwio pob cell y gellir ei staenio yr un glas, felly mae'n datgelu morffoleg (gwialennau, sfferau, troellau) a threfniant (unigol, parau, cadwyni), ond dim byd am y categori Gram. Mae staenio Gram yn ychwanegu ïodin, cam dadliwio, a gwrthstaen, felly mae'n gwahanu bacteria yn rhai Gram-bositif (porffor) a Gram-negyddol (pinc neu goch) yn ôl sut mae eu hamlenni cellog yn cadw'r lliw. Mae celloedd siâp gwialen glas ar ôl glas methylen yn golygu "mae celloedd siâp gwialen yn bresennol." Mae celloedd siâp gwialen pinc ar ôl dilyniant Gram cyflawn yn golygu "mae basilau Gram-negyddol yn bresennol." Mae'r ail ddatganiad yn gryfach oherwydd bod y weithdrefn wedi cynnal prawf ychwanegol.

I weld y teulu ehangach o ddulliau un lliw ar gyfer bacteria y mae'r erthygl hon yn perthyn iddo, gweler yr atlas staenio ar gyfer microsgopeg.

Staenio syml: un lliw, un cwestiwn

Lliw basig (cationig) yw glas methylen. Mae ei ïon lliw yn cario gwefr bositif ac yn rhwymo wrth strwythurau â gwefr negatif yn y gell, gan gynnwys asidau niwclëig a grwpiau asidig ar yr arwyneb, felly mae celloedd yn ymddangos yn las yn erbyn cefndir golau. Mae OpenStax yn disgrifio'r egwyddor hon o staenio positif yn ei bennod ar staenio. Y cation lliw ei hun yw'r ïon ffenothiasin bach, gwastad a ddisgrifir yn fanwl yn y cyfeirlyfr cemeg glas methylen; nid y gwrthïon clorid sy'n rhoi'r lliw.

Mae protocol addysgu safonol yn syml yn fwriadol: gwnewch daeniad tenau, gadewch iddo sychu yn yr aer, sefydlogwch ef â gwres, gorchuddiwch ef â thoddiant dyfrllyd o las methylen tua 1% am oddeutu un munud, rinsiwch ef yn ysgafn â dŵr, blotio'n sych, ac archwiliwch ef drwy drochi mewn olew. Mae protocol addysgu LibreTexts yn rhoi'r union drefn hon o 1% am un munud, gan nodi bod rhai labordai'n ymestyn yr amser. Dim mordant, dim dadliwiwr, dim ail liw. Yr absenoldeb hwnnw yw'r pwynt. Gydag un lliw yn unig a dim tynnu detholus, mae pob cell sy'n rhwymo'r lliw yn dod yn yr un lliw.

Gyda E. coli, y maes disgwyliedig yw celloedd siâp gwialen glas (basilau), yn unigol neu mewn parau neu grwpiau bach. Daw'r glas o'r lliw. Daw siâp y wialen o'r organeb. Ond nid yw'r cyfuniad yn adnabod yr organeb, oherwydd bod gan lawer o rywogaethau siâp gwialen a bod llawer o fasilau'n staenio'n las mewn staen syml. Mae ATCC yn nodi'n eglur yn ei ganllaw ar feithriniadau microbioleg mai morffoleg yn unig y mae'r dull yn ei ddangos. Mae adroddiad cywir yn dweud: "arsylwyd ar fasilau glas." Mae angen rhagor o dystiolaeth ar gyfer unrhyw beth y tu hwnt i siâp a threfniant.

Staenio Gram: pedwar adweithydd, un prawf ymddygiad

Staen gwahaniaethol yw staen Gram. Mae'n rhoi pob cell drwy'r un dilyniant ac yn dangos pa gelloedd sy'n cadw'r lliw cyntaf a pha rai sy'n ei golli. Mae protocolau staenio Gram Cymdeithas Microbioleg America yn diffinio'r drefn safonol o bedwar cam: fioled grisial (staen cynradd), ïodin Gram (mordant), alcohol neu alcohol aseton (dadliwiwr), yna saffranin (gwrthstaen).

Mae'r model addysgu safonol yn esbonio'r gwahaniaeth drwy strwythur yr amlen gellog. Mae gan gelloedd Gram-bositif fur peptidoglycan trwchus sy'n dadhydradu ac yn cadw'r cymhlyg fioled grisial-ïodin yn ystod y golchiad alcohol. Mae gan gelloedd Gram-negyddol haen peptidoglycan denau yn ogystal â philen allanol gyfoethog mewn lipidau y mae'r dadliwiwr yn tarfu arni, felly mae'r cymhlyg yn cael ei olchi allan ac yna mae'r celloedd yn cymryd saffranin i mewn. Mae adolygiad NCBI Bookshelf o staenio Gram yn rhoi'r esboniad hwn sy'n seiliedig ar y cellfur. Mae arbenigwyr yn ychwanegu bod y ffisigocemeg gyflawn yn fwy cymhleth na thrwch y mur yn unig, ond ar gyfer dehongli wrth fainc y labordy mae'r rheol ymddygiadol yn dal: mae porffor yn golygu bod y lliw wedi'i gadw, ac mae pinc yn golygu ei fod wedi'i golli ac yna bod gwrthstaen wedi'i ychwanegu.

Paneli enghreifftiol. Darluniau arddulliedig i gymharu dulliau, nid micrograffau camera. Mae'r lliwiau wedi'u symleiddio i ddysgu'r rhesymeg: un lliw mewn staen syml, dau liw ar ôl dadliwio Gram.

A ellir defnyddio glas methylen mewn staenio Gram

Mae dau ddehongliad i'r cwestiwn hwn, ac mae angen atebion gwahanol arnynt.

Y dehongliad cyntaf: a all un gorchudd o las methylen gymryd lle'r dilyniant Gram cyfan. Na all. Heb ïodin, dadliwiwr a gwrthstaen, nid oes cam gwahaniaethol, felly ni chaiff unrhyw gategori Gram ei brofi. Canlyniad staen syml yw maes glas ar ôl glas methylen yn unig, hyd yn oed os yw'r botel wrth ymyl yr adweithyddion Gram. Peidiwch â'i gofnodi fel canlyniad Gram.

Yr ail ddehongliad: a all glas methylen gymryd lle saffranin fel y gwrthstaen yng ngham 4. O ran ei swyddogaeth, gall liwio'r celloedd sydd wedi'u dadliwio, ac mae ymarfer mewn gwerslyfr yn rhagweld celloedd Gram-bositif porffor a chelloedd Gram-negyddol glas ar ôl newid o'r fath. Mae'r rhesymeg yn gadarn oherwydd bod celloedd Gram-negyddol sydd wedi'u dadliwio'n gywir bron yn ddi-liw a byddant yn cymryd lliw cationig arall i mewn. Ond nid dyma'r protocol safonol. Mae protocolau ASM yn pennu saffranin, gydag opsiynau cydnabyddedig eraill megis ffwcsin basig mewn rhai amrywiadau, nid glas methylen. Mae anfantais ymarferol hefyd: mae glas yn erbyn porffor yn anos ei ddehongli na phinc yn erbyn porffor, yn enwedig i ddechreuwyr ac yn enwedig dan lampau microsgop sy'n mynd yn wan. Ar gyfer gwaith cwrs ac unrhyw ganlyniad sy'n bwysig, defnyddiwch y gwrthstaen a enwir yn eich protocol, sef saffranin fel arfer, a thriniwch wrthstaen glas methylen fel amrywiad ar gyfer arddangosiad yn hytrach na safon gyfatebol.

Ymdrinnir â'r cwestiwn cysylltiedig ynghylch sut mae glas methylen yn cymharu ag opsiynau un lliw eraill mewn cymhariaeth o staeniau syml ar gyfer bacteria.

Beth y mae staen glas methylen o E. coli yn ei brofi, a beth nad yw'n ei brofi

Basilws Gram-negyddol yw E. coli, ond mae'r frawddeg honno'n cyfuno ffeithiau o sawl dull: morffoleg o ficrosgopeg, adwaith Gram o staen Gram, a hunaniaeth o feithriniad ynghyd â phrofion biocemegol neu foleciwlaidd. Dim ond y rhan gyntaf y mae taeniad glas methylen yn ei gyfrannu. Mae'n sefydlu bod celloedd siâp gwialen yn bresennol yn y sampl sydd wedi'i staenio a sut y maent wedi'u trefnu. Nid yw'n sefydlu'r adwaith Gram, oherwydd na chynhaliwyd her ddadliwio. Nid yw'n adnabod y rhywogaeth, oherwydd bod basilau llawer o rywogaethau yn edrych yn debyg ar y lefel hon o gydraniad.

Dyma lle mae adroddiadau'n mynd o chwith mewn ffordd ragweladwy. Mae'r awdur yn cynnwys gwybodaeth gefndirol ("mae'r meithriniad hwn i fod yn E. coli, ac mae E. coli yn Gram-negyddol") yn y llinell arsylwi, felly mae'r sleid yn ymddangos fel pe bai'n cadarnhau'r hyn a dybiwyd mewn gwirionedd. Mae adroddiad cliriach yn gwahanu'r haenau: "Staen syml â glas methylen: arsylwyd ar fasilau glas; morffoleg yn unig, ni phrofwyd unrhyw gategori Gram." Yna, os cynhaliwyd staen Gram yn gywir gyda rheolyddion: "Staen Gram: celloedd siâp gwialen pinc, yn gyson â Gram-negyddol." Daw hunaniaeth y rhywogaeth yn ddiweddarach, o'r llif gwaith adnabod, nid o'r lliw yn unig.

Canllaw ymarferol i ddehongli

Defnyddiwch y rheol benderfynu hon wrth fainc y labordy. Os yw pob cell yr un lliw a bod y protocol wedi defnyddio un lliw heb ddadliwiwr, rydych wedi cynnal staen syml. Cofnodwch y siâp, amcangyfrif o'r maint, a'r trefniant. Peidiwch â mynd ymhellach. Os oedd y protocol yn defnyddio fioled grisial, ïodin, dadliwiwr a gwrthstaen gyda rheolyddion positif a negatif hysbys, rydych wedi cynnal staen Gram. Cofnodwch y lliw ynghyd â'r forffoleg: cocci porffor mewn cadwyni, celloedd siâp gwialen pinc, ac ati.

Mae tri chamgymeriad yn gyfrifol am y rhan fwyaf o'r dryswch. Yn gyntaf, dehongli celloedd siâp gwialen glas fel cadarnhad o E. coli heb sail ddigonol. Yn ail, cofnodi sleid glas methylen o dan y pennawd "Staen Gram" mewn llyfr nodiadau, a fydd yn cael ei gamddehongli gan ddarllenwyr diweddarach. Yn drydydd, newid gwrthstaeniau'n ddifeddwl ac yna cymharu lliwiau ar draws labordai fel pe bai'r paletau'n cyfateb. Mae'r un ateb i bob camgymeriad: enwch y dull a gynhaliwyd mewn gwirionedd, a honwch ddim ond yr hyn y mae'r dull hwnnw'n ei brofi.

Mae staenio syml yn haeddu ei le yn union oherwydd ei fod yn honni cyn lleied. Mae'n gyflym, yn goddef mân amrywiadau, ac yn ddigonol pan fo'r cwestiwn yn ymwneud â morffoleg: a oes unrhyw beth yno, a pha siâp sydd iddo. Pan fo'r cwestiwn yn ymwneud â dosbarthu, cynhaliwch y prawf gwahaniaethol. Mae'r sleid las yn dweud wrthych sut mae'r celloedd yn edrych. Mae'r sleid borffor neu binc yn dweud wrthych sut mae eu muriau'n ymddwyn. Nid yw'r naill sleid na'r llall, ar ei phen ei hun, yn dweud wrthych beth yw'r rhywogaeth.