Esboniad o staeniau glas methylen alcalinaidd Loeffler a glas methylen polychromatig

Gall tair potel sefyll ochr yn ochr ar fainc staenio, pob un wedi'i labelu ag amrywiad ar las methylen. Mae un yn dweud glas methylen dyfrllyd 1%. Mae un yn dweud glas methylen alcalinaidd Loeffler. Mae un yn dweud glas methylen polychromatig. Mae gweithiwr prysur yn estyn am ba un bynnag sydd agosaf. Yna mae'r taeniad yn staenio'n rhy wan, neu'n rhy unffurf las, neu mewn arlliwiau annisgwyl o borffor, a rhoddir y bai am y canlyniad ar y sampl.

Problem fformwleiddio yw hon, nid problem gyda'r sampl. Mae'r tri hydoddiant yn cynnwys llifynnau cysylltiedig ond yn ymgorffori cysyniadau staenio gwahanol. Mae un yn llifyn cationig plaen ar pH sydd bron yn niwtral. Mae un yn cynnwys yr un llifyn, wedi'i wneud yn fwy grymus gan alcali. Nid yw un yn llifyn unigol mwyach o gwbl, ond yn gymysgedd sydd wedi'i ocsidio'n fwriadol. Defnyddiwch yr un anghywir ac mae'r egwyddor staenio'n newid o dan eich dwylo.

Yr ateb byr

Glas methylen dyfrllyd plaen yw'r llinell sylfaen: tua 1% o lifyn mewn dŵr, staen cationig syml ar gyfer morffoleg bacteriol a microsgopeg gyffredinol. Mae glas methylen alcalinaidd Loeffler yn ychwanegu swm bach wedi'i fesur o alcali gwanedig at hydoddiant stoc alcoholig sydd wedi'i wanhau mewn dŵr, sy'n codi'r pH ac yn gyrru'r llifyn cationig yn gryfach at strwythurau bacteriol asidig. Glas methylen sydd wedi'i aeddfedu'n fwriadol drwy ocsidio mewn alcali yw glas methylen polychromatig, felly mae'r botel yn cynnwys cymysgedd o homologau wedi'u dadfethyleiddio (azure A, azure B, azure C), thionin a fioled methylen ochr yn ochr â glas methylen gweddilliol, ac mae'r cymysgedd hwnnw'n staenio gwahanol strwythurau mewn gwahanol arlliwiau.

Os cofiwch un frawddeg yn unig: mae alcalineiddio'n newid dwyster y staenio, tra bo gwneud y llifyn yn bolychromatig yn newid lliwiau'r staenio.

Glas methylen dyfrllyd cyffredin: y pwynt cyfeirio

Y fformwleiddiad symlaf yw glas methylen wedi'i hydoddi mewn dŵr, fel arfer ar 1% w/v, heb alcali a heb ocsidio. Y rhywogaeth liwiedig yw'r cation methylthioniniwm gyda gwrthïon clorid, llifyn ffenothiasin bach, gwastad a ddisgrifir yng nghofnod glas methylen PubChem fel clorid methylthioniniwm. Fel cation, mae'n rhwymo wrth sgerbydau ffosffad asidau niwclëig a grwpiau asidig ar waliau celloedd bacteriol, gan liwio celloedd yn las yn erbyn cefndir golau.

Ei rinwedd yw ei ragweladwyedd. Mae niwclysau a bacteria yn ymddangos yn las. Mae'r cyferbyniad yn gymedrol. Gall organebau sy'n anodd eu gweld staenio'n wan, a dyna'n union y cyfyngiad y ceisiodd Loeffler ei oresgyn. I gael gwybodaeth am y teulu ehangach o staeniau bacteriol syml y mae'r hydoddiant hwn yn perthyn iddo, gweler trosolwg o staenio bacteriol syml. Mae gofal wrth wirio hunaniaeth yn dal yn bwysig yma: mae glas methyl yn foleciwl hollol wahanol, fel yr eglura glas methyl o'i gymharu â glas methylen, felly gall chwilio catalog yn ôl enw lliw yn unig arwain at y dosbarth anghywir o lifyn.

Glas methylen alcalinaidd Loeffler: yr un llifyn, wedi'i wthio'n galetach

Mae rysáit glasurol Loeffler yn cyfuno hydoddiant stoc alcoholig o las methylen ag alcali gwanedig mewn dŵr. Mae fersiynau gwerslyfrau'n galw am 0.3 g o lifyn mewn 30 mL o ethanol 95% ynghyd â 100 mL o botasiwm hydrocsid dyfrllyd 0.01% (neu, yn gyfwerth, 30 mL o las methylen alcoholig dirlawn, 100 mL o ddŵr distyll, ac 1 mL o KOH 1%), gan roi hydoddiant gweithio â thua 0.3% o lifyn ar pH sy'n amlwg yn alcalinaidd. Mae fersiynau masnachol yn dilyn yr un egwyddor, ac mae catalog staeniau microbioleg Thermo Fisher yn rhestru glas methylen alcalinaidd Loeffler ochr yn ochr â fersiynau polychromatig a dyfrllyd fel eitemau catalog ar wahân â defnyddiau bwriadedig gwahanol.

Yr alcali yw craidd yr egwyddor weithredol. Mae codi'r pH yn dadbrotonio grwpiau carbocsyl a ffosffad ar y sbesimen, gan gynyddu dwysedd safleoedd negatif, tra bo'r hydoddiant stoc ethanol yn cadw'r llifyn wedi'i hydoddi'n llwyr fel ei fod yn cyrraedd y safleoedd hynny ar ffurf fonomerig. Y canlyniad yw staenio bacteria'n gyflymach ac yn fwy dwys nag y mae llifyn dyfrllyd niwtral yn ei wneud, gyda'r rhodenni a'r cocci glas dwfn cyfarwydd mewn taeniad bacteriolegol arferol. Mae'r amser staenio fel arfer yn un i dri munud, ac yna caiff ei rinsio â dŵr.

Y defnydd clasurol yw Corynebacterium diphtheriae wedi'i dyfu ar gyfrwng serwm Loeffler: rhodenni main, yn aml ar ffurf pastwn, â gronynnau Babes-Ernst metacromatig o bolyffosffad wedi'i storio sy'n staenio'n gryf. Mae'r paru rhwng y cyfrwng a'r staen yn hanesyddol, gyda'r ddau wedi'u priodoli i'r un bacteriolegydd, a'r cyferbyniad yn y gronynnau yw'r budd diagnostig. Y tu hwnt i waith ar ddifftheria, defnyddir y staen fel staen bacteriolegol cyffredinol ar gyfer taeniadau o feithriniadau, ar gyfer morffoleg Neisseria mewn taeniadau clinigol, a lle bynnag y mae staen Gram yn ddiangen ond bod glas dyfrllyd plaen yn rhy wan. Staen monocromatig ydyw. Mae popeth asidig yn troi'n rhyw arlliw o las. Pan fydd protocol yn galw am wahaniaethu drwy liw, ni all alcali ar ei ben ei hun ddarparu hynny.

Un rhybudd ymarferol: mae hydoddiannau llifyn alcalinaidd yn dirywio ac yn ffurfio gwaddod wrth gael eu storio ac amsugno carbon deuocsid. Mae labordai naill ai'n paratoi cyfeintiau cymedrol neu'n prynu'r hydoddiant o'r catalog ac yn cadw at ei oes silff, yn hytrach na chadw hen botel i fynd sydd bellach yn gadael gwaddod ar bob sleid.

Glas methylen polychromatig: un enw, sawl llifyn

Mae glas methylen polychromatig yn dechrau gyda'r un llifyn ond yn ei roi drwy ocsidiad rheoledig mewn alcali, proses a elwid yn hanesyddol yn aeddfedu neu'n bolychromeiddio. Mae heneiddio alcalinaidd, gwresogi â charbonad, neu ocsidio ag asiantau fel deucromad yn tynnu grwpiau methyl o'r grwpiau amnewid dimethylamino fesul cam. Cymysgedd yw'r cynnyrch: glas methylen gweddilliol ynghyd ag azure B (un methyl wedi'i golli), azure A ac azure C (dadfethyleiddio pellach), thionin (wedi'i ddadfethyleiddio'n llwyr), ac is-gynhyrchion ocsidiol o deulu fioled methylen. Mae gan bob cydran ei harlliw ei hun a'i haffinedd ei hun at feinweoedd, felly mae'r cymysgedd yn staenio'n fetacromatig: mae niwclysau, gronynnau, mwcinau a chartilag yn cymryd tonau gwahanol sy'n amrywio o las i goch-borffor.

Yr un cemeg yw hon â'r gemeg y tu ôl i'r staeniau gwaed enwog. Canfu gweithwyr cynnar fod glas methylen wedi'i alcalineiddio yn staenio niwclysau parasitiaid malaria mewn arlliwiau o borffor, ond roedd eu hydoddiannau dyfrllyd wedi'u haeddfedu yn ansefydlog ac yn ffurfio gwaddod o fewn dyddiau. Mae'r adolygiad o sut y dyfeisiwyd y staen gwaed porffor yn olrhain sut y manteisiodd Malachowski a Romanowsky ar yr effaith hon yn annibynnol yn 1891, sut y cyflwynwyd methanol i sefydlogi gwaddod y llifyn a sefydlogi taeniadau heb wres, a sut y safonodd Giemsa y cymysgedd yn ddiweddarach o amgylch meintiau wedi'u mesur o azure B ac eosin, gyda glyserol i'w sefydlogi. Mae staeniau modern o fath Giemsa yn deillio'n uniongyrchol o las methylen polychromatig ynghyd ag eosin, y cyfuniad sy'n cynhyrchu effaith Romanowsky. I gael manylion am y paru ag eosin a'r gydran azure B, gweler staeniau o fath Romanowsky a'r rhyngweithiad rhwng azure B ac eosin.

Gan ei fod yn gymysgedd, glas methylen polychromatig yw'r lleiaf safonedig o'r tri yn ei hanfod. Mae ei union gydbwysedd arlliwiau'n dibynnu ar ddull a graddau'r ocsidio, a dyna pam y mae cyflenwyr histoleg yn ei werthu fel cynnyrch ar wahân â'i brofion perfformiad ei hun, yn hytrach nag fel hydoddiant Loeffler sydd wedi heneiddio. Mae defnyddiau nodweddiadol yn cynnwys dangos gronynnau mastgelloedd, mwcinau a chartilag yn fetacromatig, manylion celloedd plasma, a Helicobacter pylori mewn toriadau meinwe drwy ddulliau polychromatig o fath Goodpasture. Dyma'r dewis cywir pan mai gwahaniaethu drwy liw yw'r cwestiwn, a'r dewis anghywir pan fo'r protocol yn disgwyl silwét bacteriol monocromatig glân.

Cymharu fformwleiddiadau a dibenion

Darllenwch y tabl fel gweithdrefn benderfynu. Os yw'r sbesimen yn staenio'n rhy wan, newidiwch y cysyniad pH ac estynnwch am Loeffler. Os yw popeth yn staenio ond nad oes dim yn sefyll allan, newidiwch gysyniad y llifyn ac estynnwch am yr un polychromatig. Os yw taeniad Loeffler yn dangos gronynnau'n hyfryd ond bod y goruchwyliwr yn gofyn pam mae niwclysau a chytoplasm yn rhannu'r un glas, yr ateb yw na all unrhyw staen monocromatig alcalinaidd gyflawni'r dasg honno. Mae'r cwestiwn hwnnw'n perthyn i'r teulu polychromatig a'i ddeilliadau staen gwaed.

Osgoi'r camgymysgu arferol

Dau gamgymeriad sy'n gyfrifol am y rhan fwyaf o'r dryswch. Y cyntaf yw trin staen Loeffler fel pe bai'n gyfnewidiol â glas methylen plaen oherwydd bod y ddau'n edrych yn las yn y botel. Maent yn wahanol o ran pH a dwyster, ac mae defnyddio llifyn niwtral yn lle Loeffler pan fo hwnnw wedi'i bennu yn colli'r union gyferbyniad yn y gronynnau y lluniwyd y protocol o'i gwmpas. Yr ail yw trin unrhyw las alcalinaidd hen neu sydd wedi heneiddio'n ddamweiniol fel un polychromatig. Mae heneiddio heb reolaeth yn cynhyrchu cymysgedd anhysbys o gryfder anhysbys, tra bo hydoddiannau polychromatig gwirioneddol yn cael eu paratoi drwy ddulliau ocsidio diffiniedig ac, yn llinach y staeniau gwaed, yn cael eu cyfuno â meintiau wedi'u mesur o eosin. Mae hanes yn wers yma: ildiodd hydoddiannau dyfrllyd ansefydlog wedi'u haeddfedu'r 1890au i fformwleiddiadau methanolig wedi'u sefydlogi yn union oherwydd na ellid atgynhyrchu cymysgeddau heb reolaeth, gwers sy'n werth ei chofio cyn staenio sleid ddiagnostig o botel nad yw ei hoedran yn sicr.

Mae gofal wrth ddefnyddio enwau yn cwblhau'r darlun. Cadarnhewch eitem y catalog (dyfrllyd yn erbyn Loeffler yn erbyn polychromatig), cynnwys y llifyn, a'r defnydd bwriadedig ar y label yn hytrach na'u casglu o'r lliw. Mae'r tri fformwleiddiad yn rhannu hynafiad cromoffor. Nid ydynt yn rhannu diben.